江冠民,匡艷華,邱 瑜,謝婉瑩,張秋桂,歐陽(yáng)新平

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南長(zhǎng)沙,410078;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科;3.湖南省兒童醫(yī)院ICU科;4.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室)

目前,腫瘤的免疫治療已經(jīng)成為繼外科治療、內(nèi)科治療、放射治療之后的第四大治療策略,然而,腫瘤的免疫治療策略的臨床研究結(jié)果并沒(méi)有預(yù)期的那么理想。其主要原因是當(dāng)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境之后,其功能受到抑制,失去其應(yīng)有的殺死腫瘤細(xì)胞的功能,從而導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受[1-2]。這也是腫瘤免疫治療一直無(wú)法實(shí)現(xiàn)根本性突破的重要原因之一。目前,大量研究證實(shí),吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是導(dǎo)致腫瘤免疫耐受的主要因子之一[3-4]。IDO是犬尿氨酸(Kyn)途徑中代謝必需氨基酸-色氨酸的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶,它可通過(guò)消耗局部的色氨酸而產(chǎn)生有毒降解產(chǎn)物,如Kyn等,從而使T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞NK細(xì)胞增殖抑制、失活和凋亡[5-6]。

IDO的表達(dá)可受IFN-γ誘導(dǎo)。IFN-γ是由激活的T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的一種重要的細(xì)胞因子,其在腫瘤免疫治療中具有雙重作用:一方面,IFN-γ通過(guò)介導(dǎo)Fas依賴(lài)和非Fas依賴(lài)細(xì)胞凋亡途徑改變腫瘤細(xì)胞的特性而更有利于宿主免疫識(shí)別和免疫攻擊;另一方面,由于IFN-γ誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞IDO表達(dá)而引起機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受[7-8]。因此,目前很多學(xué)者認(rèn)為IDO的高表達(dá)是導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫耐受的重要因素之一。

IDO基因已被克隆表達(dá),其啟動(dòng)子區(qū)域也已被鑒定;IDO基因啟動(dòng)子包含了一系列假定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),包括兩個(gè)相距1000nt的ISRE區(qū)域,一個(gè)接近ISRE-1和ISRE-2的GAS序列、兩個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)[9-10]。STAT1作為調(diào)節(jié)受IFN-γ誘導(dǎo)的IDO表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,它由IFN-γ受體胞質(zhì)尾區(qū)的JAK激酶激活,發(fā)生同源二聚化并轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi),然后結(jié)合GAS序列,直接激活I(lǐng)DO和IRF-1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。另外,STAT1也能通過(guò)誘導(dǎo)IRF-1的表達(dá),使之結(jié)合IDO基因調(diào)節(jié)區(qū)的ISRE-1和ISRE-2元件,從而間接地激活I(lǐng)DO基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[11-12]。

本研究擬通過(guò)合成調(diào)控IDO表達(dá)的啟動(dòng)序列ISRE4(4個(gè)串聯(lián)的ISRE序列)和GAS7(7個(gè)串聯(lián)的GAS序列),與pGL3-Enhancer空白載體連接構(gòu)建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因載體,用于探討IDO表達(dá)調(diào)控的具體分子機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)途徑和為以IDO為靶標(biāo)的抗腫瘤免疫耐受藥物的快速高通量的篩選提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α和人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2由中山大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;質(zhì)粒pGL3-Enhancer購(gòu)于Promega公司,該質(zhì)粒含熒光素酶基因(lueiferase gene,Luc);內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK購(gòu)于Promega公司,該質(zhì)粒能表達(dá)海腎蛋白;ISRE4和GAS7由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,其中ISRE4為四個(gè)連續(xù)的ISRE序列(其共有序列為:AGTTTCNNTTCNC/T)串聯(lián)而成;GAS7為七個(gè)連續(xù)的GAS序列(其共有序列為:TTC/ANNNG/TAA)串聯(lián)而成。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司;熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司;核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa公司;限制性?xún)?nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ,T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司;瓊脂糖粉購(gòu)自Shanghai Yito Enterprise Company;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自invitrogen公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純以上。

1.2 方法

1.2.1 IDO啟動(dòng)子ISRE和GAS序列的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,GAS序列的共有序列為:TTC/ANNNG/TAA,ISRE序列的共有序列為:AGTTTCNNTTCNC/T[13],因此我們串聯(lián)了7個(gè) GAS序列GAS7做為GAS的啟動(dòng)子序列,串聯(lián)了4個(gè)ISRE序列ISRE4做為ISRE的啟動(dòng)子序列。GAS7和ISRE4的正義鏈和反義鏈(分別包括MluⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)序列)如下:GAS7序列(正義鏈):5′-CGACGCGTTTCCAGGAATTCCAGGAATTACAGTA ATTACAGTAATTCCAGTAATTCCTGTAATTCCTGTAA CTCGAGCGG-3′;GAS7序列(反義鏈):5′-CCGCTCGA GTTACAGGAATTACAGGAATTACTGGAATTACTGTA ATTACTGTAATTCCTGGAATTCCTGGAAACGCGTCG-3′;ISRE4序列(正義鏈):5′-CGACGCGTAGTTTCGA TTCGTAGTTTCGATTCGTAGTTTCAGTTCCTAGTTTC AGTTCCTCTCGAGCGG-3′;ISRE4序列(反義鏈):5′-CCGCTCGAGAGGAACTGAAACTAGGAACTGAAACT ACGAATCGAAACTACGAATCGAAACTACGCGTCG-3′。

1.2.2 IDO啟動(dòng)序列熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建 首先,取合成的單鏈目的片段GAS7和ISRE4進(jìn)行退火,采取用退火緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA)溶解合成的單鏈目的片段,等摩爾數(shù)混合,總體積不要超過(guò)500 μL,加熱到95℃,反應(yīng)2 min,然后緩慢冷卻至室溫,得到雙鏈GAS7和ISRE4,兩個(gè)雙鏈目的片段分別用MluⅠ和XhoⅠ雙酶切,同時(shí)質(zhì)粒小提試劑盒小提質(zhì)粒pGL3-Enhancer,并經(jīng)MluⅠ和XhoⅠ雙酶切,利用凝膠回收試劑盒回收并純化酶切產(chǎn)物。將上述制備的IDO啟動(dòng)序列GAS7和ISRE4片段與線性化雙粘性末端的pGL3-Enhancer載體片段以3∶1摩爾比的比例用T4 DNA連接酶于16℃循環(huán)水浴連接反應(yīng)過(guò)夜,連接產(chǎn)物于60℃滅活10 min后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α,經(jīng)氨芐霉素抗性篩選,分別取陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc和pGL3-Enhancer-ISRE4-luc并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前一天,以2×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種到96孔培養(yǎng)板上。待細(xì)胞匯合率到達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以25 μL無(wú)血清培養(yǎng)基加 0.5 μL Lipofectamine 2 000每孔(溫育5min)配制溶液1;以25 μL無(wú)血清培養(yǎng)基加0.2 μg質(zhì)粒每孔(檢測(cè)質(zhì)粒:內(nèi)參質(zhì)粒=5∶1)配置溶液2;將溶液1與溶液2混合,室溫下靜置20 min。與此同時(shí),將96孔板中的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗兩遍后,每孔加入50 μL RPMI 1640無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基。將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中,搖動(dòng)培養(yǎng)板,輕輕混勻。在37℃,5%的CO2中培養(yǎng)4～6 h后把培養(yǎng)基更換為含血清和雙抗的完全培養(yǎng)基,同時(shí)加入加入500 U/mL的INF-γ刺激,并設(shè)陰性對(duì)照組,在37℃,5%的CO2中培養(yǎng)24 h后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況。

1.2.4 熒光素酶活性檢測(cè) 將96孔板轉(zhuǎn)染了熒光素酶報(bào)告基因的CNE2細(xì)胞培養(yǎng)上清吸棄,每孔加裂解液75 μL,裂解15 min后,轉(zhuǎn)移至96孔板白板中,將96孔板置于熒光檢測(cè)儀檢測(cè),將讀取的數(shù)據(jù),做柱狀圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)值均以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間的比較采用雙尾不配對(duì)t檢驗(yàn),多重比較采用邦弗朗尼檢驗(yàn)后進(jìn)行單向方差分析。這些數(shù)據(jù)處理使用GraphPad Prism軟件版本4.0(GraphPad軟件公司)。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因與載體pGL3-enhancer的雙酶切鑒定

目的基因GAS7和ISRE4的獲得分別用上述方法里面合成的單鏈,用退火緩沖液溶解合成的單鏈目的片段,等摩爾數(shù)混合,加熱到95℃,反應(yīng)2 min,然后緩慢冷卻至室溫,即得到目的基因GAS7和ISRE4。目的基因與載體pGL3-enhancer都分別用限制性?xún)?nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ雙酶切,形成粘性末端。目的片段由于只有幾十個(gè)堿基大小,沒(méi)法通過(guò)電泳結(jié)果顯示其大小。載體pGL3-enhancer的酶切后,取部分進(jìn)行凝膠電泳,結(jié)果顯示(圖1),在5 Kb大小附近,發(fā)現(xiàn)一條明亮的條帶,與載體預(yù)期大小一致。

圖1 載體pGL3-enhancer的雙酶切結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc和pGL3-Enhancer-ISRE4-luc的雙酶切鑒定

通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ雙酶切的GAS7和ISRE4分別與雙酶切的pGL3-enhancer在含連接酶的10 μL的連接體系中16℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌中,在含氨芐的細(xì)菌培養(yǎng)平板上涂板過(guò)夜。分別挑單克隆培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒,分別MluⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。結(jié)果顯示(圖2),重組質(zhì)粒 pGL3-Enhancer-GAS7-luc和pGL3-Enhancer-ISRE4-luc均能被MluⅠ和XhoⅠ雙酶切,酶切片段大小在5 kb附近,由于插入的GAS7和ISRE4片段較小,在凝膠電泳結(jié)果上無(wú)法顯示。因此通過(guò)雙酶切結(jié)果初步鑒定,重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc和pGL3-Enhancer-ISRE4-luc構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步確定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功,我們把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒送至上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果完全正確(圖3～4),因此,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc和pGL3-Enhancer-ISRE4-luc雙酶切結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc插入片段測(cè)序圖

圖4 重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-ISRE4-luc插入片段測(cè)序圖

2.3 重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc和pGL3-Enhancer-ISRE4-luc活性鑒定

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc,pGL3-Enhancer-ISRE4-luc和空白對(duì)照pGL3-Enhancerluc質(zhì)粒分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK按5∶1的比例轉(zhuǎn)染入CNE2細(xì)胞,分別加入或不加入500 U/mL的INF-γ刺激,在37℃,5%的CO2中培養(yǎng)24 h后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖5～7),INF-γ能顯著地增強(qiáng)pGL3-Enhancer-GAS7-luc和pGL3-Enhancer-ISRE4-luc熒光素酶的表達(dá)活性,但是INF-γ并不影響空白質(zhì)粒pGL3-Enhancer-luc的熒光素酶活性,說(shuō)明GAS7和ISRE4序列已經(jīng)準(zhǔn)確插入到了熒光素酶基因上游,已經(jīng)成功的構(gòu)建了具有生物活性的重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-GAS7-luc和 pGL3-Enhancer-ISRE4-luc。

圖5 pGL3-Enhancer-GAS7-luc的相對(duì)熒光值

圖6 pGL3-Enhancer-ISRE4-luc的相對(duì)熒光值

圖7 pGL3-Enhancer-luc的相對(duì)熒光值

3 討 論

目前關(guān)于IDO介導(dǎo)的腫瘤免疫耐受研究已成為腫瘤免疫學(xué)的研究焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。很多證據(jù)表明,在很多腫瘤細(xì)胞類(lèi)型中,由于IFN-γ誘導(dǎo)的IDO表達(dá)而引起機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受。因此,以IDO為靶標(biāo)的抗腫瘤免疫治療具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。抑制IDO的功能可以通過(guò)抑制它的表達(dá)或通過(guò)抑制其活性來(lái)實(shí)現(xiàn),在小鼠腫瘤模型中,IDO的抑制劑1-MT聯(lián)合多種化學(xué)治療劑能夠協(xié)同抑制轉(zhuǎn)移性黑素瘤和原發(fā)乳腺癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[14]。用于基因沉默的治療性核酸尤其是RNA干擾技術(shù)可通過(guò)使IDO基因被沉默而達(dá)到抑制IDO表達(dá)的結(jié)果,這是一種非常有前景的特異抗癌治療手段[15]。

本文通過(guò)合成調(diào)控IDO表達(dá)的啟動(dòng)序列ISRE4(4個(gè)串聯(lián)的ISRE序列)和GAS7(7個(gè)串聯(lián)的GAS序列),與 pGL3-Enhancer連接成重組體 pGL3-Enhancer-ISRE4和 pGL3-Enhancer-GAS7,通過(guò)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增,篩選出陽(yáng)性克隆,并通過(guò)酶切,測(cè)序鑒定及生物學(xué)活性的檢測(cè),結(jié)果表明,我們成功地構(gòu)建了pGL3-Enhancer-ISRE4和 pGL3-Enhancer-GAS7兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因載體,并在細(xì)胞內(nèi)鑒定了在IFN-γ的誘導(dǎo)下,能啟動(dòng)熒光素酶的表達(dá),因此充分證明了我們構(gòu)建的pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7是具有生物學(xué)功能的。從而為研究IDO蛋白的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和以IDO為靶標(biāo)的抗腫瘤免疫耐受藥物快速高通量的篩選提供了非常重要的研究工具。

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