徐曉臣，趙冉冉，徐 飛，李彥改，陳朝旺，檀國軍

(1.邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市第一醫(yī)院泌尿科，河北 邯鄲 056002；4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050071)

·論 著·

α-硫辛酸對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠脊髓組織IL-17表達(dá)的影響

徐曉臣1，趙冉冉2，徐 飛3，李彥改1，陳朝旺2，檀國軍4

(1.邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市第一醫(yī)院泌尿科，河北 邯鄲 056002；4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050071)

目的研究α-硫辛酸(Alpha-lipoic acid，ALA)對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型中脊髓組織IL-17表達(dá)的影響。方法健康雌性Wistar大鼠50只，隨機分為正常對照組(NC組)，EAE 7 d組(EAE-7 d組)、EAE 6個月病程組(EAE-6 m組)、硫辛酸急性期組(ALA-7 d組)和硫辛酸6個月病程組(ALA-6 m組)。HE染色觀察病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色觀察IL-17的表達(dá)變化。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，在α-硫辛酸治療急性期組和6個月病程組，均可減輕脊髓組織的炎性反應(yīng)和髓鞘損傷。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，EAE-7 d組大鼠IL-17蛋白的表達(dá)比正常對照組增加(P＜0.01)；EAE-6 m組大鼠IL-17蛋白的表達(dá)比正常對照組增加(P＜0.01)；α-硫辛酸處理后急性期組和6個月病程組IL-17蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論α-硫辛酸在EAE大鼠模型中的保護作用可能是通過抑制IL-17的表達(dá)來實現(xiàn)的。

多發(fā)性硬化；α-硫辛酸；炎癥；IL-17

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)和實驗性自身變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎動物模型，都是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性和脫髓鞘改變?yōu)椴±硖卣鞯募膊?，對自身髓鞘的免疫反?yīng)參與疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程，其中。近年來研究發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸(Alpha-lipoic acid，ALA)在EAE模型中具有保護作用[1]，但其發(fā)揮治療作用的機制還不明確，國外研究發(fā)現(xiàn)ALA有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖從而抑制自身免疫的作用[2]。本研究應(yīng)用大鼠EAE模型觀察ALA對脊髓組織炎癥細(xì)胞浸潤和IL-17表達(dá)的影響，探討ALA對EAE保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性Wistar大鼠50只，8周齡，體重(190±10)g；清潔級豚鼠3只，體重(370±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 α-硫辛酸(Sigma公司)，卡介苗(北京生物制品研究所)，兔抗多克隆抗體IL-17(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。主要儀器：石蠟切片機(德國萊卡RM2015)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS BX51T-PHD-J11)。

1.3 動物模型的建立 3只健康豚鼠用水合氯醛350 mg/kg麻醉，快速取脊髓，去除脊膜稱重后，按照脊髓重量與冰鹽水體積為1:10的比例制成豚鼠脊髓勻漿，并與等量含6 mg/ml卡介苗的完全福氏佐劑混合，在冰上抽打制備成油包水乳劑，為完全免疫抗原。分別于大鼠四肢足墊及背部皮下5個部位注射抗原勻漿(0.5 ml/只)，從而建立EAE大鼠模型。

1.4 實驗分組 健康雌性Wistar大鼠隨機分為五組：對照組(NC組)、EAE 7 d組(EAE-7 d組)、EAE 6個月病程組(EAE-6 m組)、α-硫辛酸急性期組(ALA-7 d組)和α-硫辛酸6個月組(ALA-6 m組)，每組各10只。ALA-7 d組和ALA-6 m組自第一次發(fā)病起給予藥物腹腔注射，連續(xù)注射7 d(100 mg·kg-1·d-1)。

1.5 HE染色及免疫組織化學(xué)檢查 磷酸鹽緩沖液(PBS)和4%多聚甲醛灌注大鼠后，取脊髓，石蠟包埋，常規(guī)切片，行HE染色及免疫組織化學(xué)IL-17染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。對IL-17免疫組化應(yīng)用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測定陽性細(xì)胞平均光密度值(Average optical density，AOD)，以AOD值代表目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，AOD數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用ANOVA，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 EAE-7 d組大鼠脊髓組織內(nèi)可見明顯單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞樣浸潤，血管周圍有明顯炎性浸潤，神經(jīng)元髓鞘稀疏，ALA-7 d組比EAE-7 d組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，髓鞘結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，EAE-6m組大鼠脊髓組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤，部分髓鞘稀疏，ALA-6 m組較EAE-6 m組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，髓鞘結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，見圖1。

圖1 大鼠脊髓病理改變（HE染色，400×）

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 NC組、EAE-7 d組、ALA-7 d組、EAE-6 m組和ALA-6 m組五組大鼠脊髓陽性細(xì)胞AOD值分別為(0.23±0.01)、(0.52±0.04)、 (0.38±0.03)、(0.48±0.06)、(0.39±0.04)，IL-17蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.13，P＜0.01)，見圖2。EAE-7 d組IL-17蛋白表達(dá)比正常對照組增加118%，EAE-6 m組IL-17蛋白表達(dá)比正常對照組增加100% (t=3.85，P＜0.01)。α-硫辛酸處理后急性期組和6個月病程組IL-17蛋白的表達(dá)明顯降低，表現(xiàn)為ALA-7 d組IL-17蛋白免疫反應(yīng)強度的AOD值比EAE-7 d組降低33%(t=2.65，P＜0.01)；ALA-6 m組大鼠IL-17蛋白免疫反應(yīng)強度的AOD值比EAE-6 m組降低了22%(t=3.98，P＜0.01)。

圖2 各組大鼠脊髓IL-17陽性細(xì)胞AOD值

3 討論

EAE模型很好的模擬了MS的病理過程，其神經(jīng)功能評分、組織病理學(xué)、特異性T細(xì)胞增殖及其炎性細(xì)胞因子的反應(yīng)等方面符合MS的發(fā)病[3-4]，廣泛應(yīng)用于MS的實驗研究。MS的發(fā)病由多種機制參與，IL-17在MS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用，IL-17/IL-23軸目前被認(rèn)為是MS最重要的治療靶點。IL-17作為前炎性細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖和分化、生物因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮了重要作用[5]。研究表明，IL-17在MS患者外周血單核細(xì)胞表達(dá)數(shù)量高于健康對照組，且表達(dá)水平增高與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)[6]，應(yīng)用抑制IL-17活性的藥物能夠減輕EAE病情嚴(yán)重程度[7]。

MS可侵犯大腦、小腦、腦干、視神經(jīng)及脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個部位。本實驗中觀察到，脊髓運動神經(jīng)元的病變主要表現(xiàn)為脫髓鞘和炎性細(xì)胞浸潤，造成局部能量代謝障礙，ATP含量減少，使神經(jīng)通透性增加、組織液含量增加，導(dǎo)致軸漿內(nèi)水含量增多，最終造成軸突腫脹和髓鞘的松解，IL-17在上述病理過程中可能發(fā)揮了重要作用。

α-硫辛酸(Alpha-lipoicAcid，ALA)為維生素類藥物，也是一種強抗氧化劑，主要通過清除自由基和活性氧、螯合金屬離子、再生其他內(nèi)源性抗氧化劑而發(fā)揮其抗氧化作用[8]，在細(xì)胞和動物模型中證實具有抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)[9]、神經(jīng)保護[10]、保護血腦屏障[11]、改善認(rèn)知[12]、調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺含量[13]、保護線粒體[14]等作用，作為神經(jīng)保護劑已被應(yīng)用于多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的防治[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，EAE-7 d組大鼠和EAE-6 m組大鼠脊髓前角細(xì)胞有明顯炎性細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)稀疏，EAE-7 d組大鼠的炎性浸潤和髓鞘結(jié)構(gòu)損傷比EAE-6 m組要嚴(yán)重，提示豚鼠脊髓勻漿注射成功制作大鼠EAE模型，在急性期和半年期均存在有較強的炎性浸潤和神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)的損壞，ALA-7 d組大鼠和ALA-6 m組大鼠的炎性浸潤、神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)較相應(yīng)的對照組明顯好轉(zhuǎn)，提示α-硫辛酸對EAE短期和長期病程中存在的脊髓炎性浸潤和髓鞘損傷有明顯的改善作用。此外，通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)IL-17蛋白在EAE-7 d組大鼠和EAE-6 m組大鼠脊髓表達(dá)明顯升高，α-硫辛酸治療組IL-17的表達(dá)顯著降低，提示EAE病程中在急性期和半年期均存在有較強的炎癥反應(yīng)，α-硫辛酸治療后其炎癥反應(yīng)明顯減輕。上述結(jié)果提示：α-硫辛酸可能通過抑制IL-17的表達(dá)和減輕EAE大鼠模型脊髓的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

綜上所述，大鼠發(fā)病急性期及半年時脊髓運動神經(jīng)元存在炎癥反應(yīng)、脫髓鞘損傷，α-硫辛酸處理大鼠脊髓運動神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)、脫髓鞘損傷明顯減輕。本實驗結(jié)果為進一步研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的機制及多發(fā)性硬化的防治提供了重要的實驗依據(jù)。

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Effect of alpha-lipoic acid on IL-17 expression in rats with experimental allergic encephalomyelitis.

XU Xiao-chen1,ZHAO Ran-ran2,XU Fei3,LI Yan-gai1,CHEN Chao-wang2,TAN Guo-jun4.

1.Department of Neurology, the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA;2.Department of Emergency,the First Hospital of Handan, Handan 056002,Hebei,CHINA;3.Department of Urology,the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA; 4.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050071,Hebei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of alpha-lipoic acid(ALA)on IL-17 expression in rats with experimental allergic encephalomyelitis(EAE).MethodsFifty female Wistar rats were divided randomly into five groups:the normal control group(NC group),EAE model group with 7 days(EAE-7 d group),EAE model group with 6 months(EAE-6 m group),ALA administrated EAE model group with 7 days(ALA treated EAE-7 d group), ALA administrated EAE group with 6 months(ALA treated EAE-6 m group).HE staining was used to detect the pathologic changes.Immunohistochemistry was used to detect the expression of IL-17.ResultsHE staining showed that,in alpha-lipoic acid treated groups(ALAtreated EAE-7 d group,ALAtreated EAE-6 m group),inflammatory reaction and myelin damage were all relieved.According to immunohistochemistry,the expression of IL-17 in EAE-7 d group and in EAE-6 m group was significantly increased compared to NC group(P＜0.01).However,the expression of IL-17 in alpha-lipoic acid treated groups significantly decreased compared with EAE-7 d group and EAE-6 m group respectively(P＜0.01).ConclusionAlpha-lipoic acid may exert its neuroprotective effect through ameliorating inflammative reacts.

Mutiple sclerosis;Alpha-lipoic acid;Inflammation;IL-17

R-332

A

1003—6350（2014）24—3589—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1403

2014-08-07)

河北省科技廳課題（編號：11276425）

檀國軍。E-mail：ttguojun@hotmail.com