韓新會 （山東濱州沃華生物工程有限公司 256606）

IBD毒株的卵黃培養(yǎng)方法研究

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本研究表明，IBD毒株首次分離以雞胚絨毛尿囊膜(CAM)接種為首選，卵黃囊接種次之。本試驗將經(jīng)CAM馴化的雞胚適應(yīng)毒轉(zhuǎn)卵黃囊(Yolk sac)馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果顯示卵黃囊接種的方法，CAM、胚體及尿囊液混合物中的病毒含量高于CAM接種方法的病毒含量，提示該接種方法可用于規(guī)模化培養(yǎng)。

IBDV毒株 卵黃培養(yǎng) 病毒含量 產(chǎn)量

雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)能在雞胚上生長增殖，Hitchner[1]證明9～11日齡雞胚絨毛尿囊膜(CAM)是分離病毒最敏感的接種途徑，感染的雞胚通常在3～5日內(nèi)出現(xiàn)死亡，雞胚CAM增厚或出現(xiàn)痘斑、腹部水腫、肝壞死、脾腫大及心臟魚肉樣病變。IBDV也可以適應(yīng)尿囊腔和卵黃囊(Yolk sac)接種。初次分離以CAM接種為首選，卵黃囊接種次之，尿囊腔接種為最差，感染的雞胚以CAM和肝含毒量最高，尿囊液最低[2]。實際生產(chǎn)中，盡管CAM的病毒含量比較高，但由于產(chǎn)量低并且接種CAM方法操作麻煩，不利于擴大生產(chǎn)。因此，找到一種既方便操作又能提高產(chǎn)量的雞胚培養(yǎng)方式，是生產(chǎn)實踐中急需解決的問題。

通過臨床癥狀和病理剖檢結(jié)合實驗室方法[3]確診并順利分離到一株IBDV野毒株，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)感染死亡的雞胚胚體出血腫大，肝腫大壞死外，還發(fā)現(xiàn)卵黃囊也發(fā)生病變?nèi)绯鲅?。通過卵黃囊接種，收取死亡雞胚的CAM、胚體、尿囊液的混合物，然后與CAM進行病毒含量的比較，試驗表明該方法得到的IBDV病毒含量不低于CAM，而產(chǎn)量卻明顯提升，所以該方法有一定的可行性，值得推廣嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

雞傳染性法氏囊病野毒株，2008年分離鑒定[3]獲得；SPF雞胚(購自山東省無特定病原雞試驗種雞場)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司)；旋渦混合器(太倉市科教器材廠)；DS-1組織搗碎機(江蘇金偉儀器廠)；生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 IBDV野毒株的培養(yǎng)及病毒含量測定 選擇11日齡發(fā)育正常SPF雞胚，在雞胚側(cè)壁打孔做人工氣室，將IBDV病料取出融化，4000r/min離心15min，取上清過濾，接種雞胚CAM，每枚0.2ml，共接種10枚，37℃培養(yǎng)。接種后24h、48h內(nèi)照胚1次/d，去掉死亡雞胚，以后照胚2次/d，連續(xù)觀察至120h，將死胚放4℃保存，詳細記錄雞胚死亡時間，最后集中無菌收取所有死亡雞胚的CAM，凍融3次后標(biāo)記C1代，置-20℃保存。將保存的C1代CAM凍融2次后，取出研碎，接種雞胚CAM進行C2代的培養(yǎng)，最后收取死亡雞胚的CAM凍融保存。以同樣方式進行C3、C4、……傳代培養(yǎng)。

將每代收獲CAM作10倍系列稀釋，取連續(xù)5個稀釋度接種雞胚CAM，每個稀釋度接種5枚雞胚，每枚接種0.2ml，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，接種后連續(xù)照胚144h，棄去48h內(nèi)死亡雞胚，記錄48～144h內(nèi)死亡雞胚的數(shù)量，根據(jù)Eeed-Muench計算方法計算每代的半數(shù)致死量。

1.2.2 IBDV的卵黃囊接種培養(yǎng)及病毒含量測定 將經(jīng)CAM接種穩(wěn)定的IBDV接種7日齡發(fā)育正常SPF雞胚卵黃囊，每枚雞胚接種0.2ml，共接種10枚，每天照胚，連續(xù)觀察至接種后120h，收獲接種后48～120h內(nèi)死亡雞胚的CAM、胚體、卵黃以及尿囊液，記錄為Y1，置－20℃保存。將Y1凍融2次后取出，離心取上清接種雞胚卵黃囊，進行Y2代培養(yǎng)，收獲死亡雞胚CAM、胚體、卵黃以及尿囊液，如此進行Y2、Y3、……的傳代。依照1.2.1檢測方法進行Y1、Y2、Y3……病毒含量的測定。

2 結(jié)果

2.1 IBDV雞胚CAM培養(yǎng)結(jié)果及病毒含量

CAM接種，雞胚死亡時間比較集中，主要集中在接種后72～96h之間，死亡雞胚的CAM增厚，有時可見痘斑；胚體較正常雞胚小，并且水腫出血；雞胚卵黃囊出血；剖檢雞胚可見肝臟腫大，有白色壞死灶；脾腫大，布滿白色壞死灶，整體紅白相間；肺充血於血，腎腫大出血、充血。病毒含量測定結(jié)果如表1：

表1 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測定結(jié)果

2.2 IBDV雞胚卵黃囊培養(yǎng)結(jié)果及病毒含量

將C4代作為雞胚卵黃囊接種的種毒接種雞胚卵黃囊，雞胚死亡時間集中在接種后60～96h，死亡雞胚胚體水腫出血，較正常雞胚小，卵黃囊出血，肝腫大出血。病毒含量測定結(jié)果如表2：

表2 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測定結(jié)果(枚)

2.3 不同接種方式病毒含量比較

從表中可以看出卵黃囊接種所收獲混合物病毒含量與CAM接種所收獲病毒含量區(qū)別不大，在同一代次下，二者并無統(tǒng)計學(xué)意義的差異，而僅收獲CAM的數(shù)量卻遠低于收獲的卵黃囊、CAM、胚體與尿囊液混合物體積。

表3 病毒含量結(jié)果比較

3 討論

IBDV野毒株比較容易適應(yīng)雞胚CAM，成為雞胚適應(yīng)毒，在本實驗中，IBDV野毒株在雞胚CAM培養(yǎng)至第四代達到了穩(wěn)定狀態(tài)，并且死亡時間集中，病變典型，證明該IBDV野毒株能夠很快適應(yīng)雞胚CAM培養(yǎng)。IBDV也比較容易適應(yīng)雞胚卵黃囊，而且卵黃中病毒含量較高，將此雞胚適應(yīng)毒由CAM接種轉(zhuǎn)化為卵黃囊接種，該毒能夠順利實現(xiàn)由CAM培養(yǎng)向卵黃囊培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化，并且能夠保持在穩(wěn)定狀態(tài)，同時得到的卵黃囊、CAM、胚體及尿囊液混合物病毒含量不低于雞胚CAM的病毒含量，張春杰等人[4、5]也曾證明經(jīng)卵黃囊接種馴化后的雞胚適應(yīng)毒，在卵黃囊內(nèi)可以達到較高的水平，由此將雞胚CAM接種方式轉(zhuǎn)為卵黃囊接種方式，更有利于擴大生產(chǎn)規(guī)模。另外，雞胚卵黃囊接種方式，使病毒的收獲量得到了很大的提高，同時由于雞胚接種日齡提前，減少了雞胚的培養(yǎng)時間，節(jié)約了生產(chǎn)成本，具有推廣優(yōu)勢。

IBDV的初次分離以CAM接種為首選，卵黃囊接種次之，說明雞胚卵黃囊接種培養(yǎng)不失為一種分離培養(yǎng)IBDV的方式，而且在本試驗過程中證明卵黃囊接種的雞胚胚體、尿囊液以及CAM混合物病毒含量不低于CAM，進一步說明采用雞胚卵黃囊培養(yǎng)具有一定生產(chǎn)實踐意義，但是IBDV雞胚培養(yǎng)收獲中卵黃容易液化混入尿囊液中，由于卵黃的成分復(fù)雜，對病毒的免疫原性以及制備疫苗是否有影響有待于作進一步試驗研究。

[1] Hitchner, S. B. 1970. Infectivity of infectious bursal disease virus for embryonating eggs[M]. Poult Sci 49: 611-613.

[2] 殷震, 劉景華. 動物病毒學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社，1997.

[3] 世界動物衛(wèi)生組織著. 農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局譯. 哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2002: 606-615.

[4] 張春杰, 程相朝, 鄭祥海. 不同途徑擱雞胚培養(yǎng)傳染性法氏囊病病毒的比較研究[J]. 中國獸醫(yī)科技, 1996, 26(4): 25-27.

[5] 張春杰, 陳樹光, 鄭祥海. 雞傳染性法氏囊病毒雞胚適應(yīng)株的培育[J]. 河南畜牧獸醫(yī), 1998, 19(1): 24-26.

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