王 然，殷會瑩，郭明申，劉淑卓，葛少欽

（1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000; 3. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定 071000）

非梗阻性不育患者精子膜超微結(jié)構(gòu)研究

王 然1，殷會瑩1，郭明申2，劉淑卓3，葛少欽1

（1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000; 3. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定 071000）

目的 研究非梗阻性不育患者精子膜超微結(jié)構(gòu)的改變，探討非梗阻性不育患者精子膜超微結(jié)構(gòu)缺陷對男性不育的影響。方法 利用透射電鏡對臨床非梗阻性不育患者新鮮精液標本中精子膜的超微結(jié)構(gòu)進行觀察。結(jié)果 在電鏡下，發(fā)現(xiàn)該不育男性患者精子多存在質(zhì)膜、頂體外膜和/或頂體內(nèi)膜等畸變，膜結(jié)構(gòu)呈多形態(tài)超微結(jié)構(gòu)異常的現(xiàn)象，此外，精子核、頸部和線粒體、微管等超微結(jié)構(gòu)也存在病理性改變。結(jié)論 精子膜超微結(jié)構(gòu)畸變是非梗阻性男性不育原因之一。

非梗阻性不育；精子膜；超微結(jié)構(gòu)

隨著社會不斷發(fā)展，各種應(yīng)激因素不斷加劇，男性不育作為生殖異常中較容易出現(xiàn)的問題，近年來發(fā)病率不斷增加。目前，全世界有15%～20%的育齡夫婦存在生育障礙，其中男性原因?qū)е虏挥谋壤?0%～50%[1]。在臨床檢驗中，傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析包括精子計數(shù)、活動力和形態(tài)學(xué)分析是主要的研究方法。但是除無精子癥、死精子癥或畸精子癥等少數(shù)嚴重的男性不育癥外，精液常規(guī)分析在精確診斷和預(yù)測精子的體內(nèi)外受精能力等方面存在很大的局限性。臨床上存在不少不育患者精液常規(guī)分析提示正常，但不能使正常育齡女性受孕的情況[2]。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，不育男性精子不僅存在光鏡形態(tài)學(xué)異常和免疫動力學(xué)改變，而且精子的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了病理性改變，精液常規(guī)分析不能客觀反映精子受精能力。為全面評價精子受精能力，電鏡觀察精子超微結(jié)構(gòu)亦是必要的[3]，而其中精子膜結(jié)構(gòu)完整性在保證精子質(zhì)量中的作用不容忽視。

精子膜超微結(jié)構(gòu)的完整性在正常受精過程中起著重要作用[3]。在電鏡下觀察精子膜超微結(jié)構(gòu)的改變，通過對其結(jié)構(gòu)的變化與男性不育之間的關(guān)系進行觀察分析，不僅可以為不育癥病因?qū)W研究增加一項客觀的指標，而且還可以更好地預(yù)測男性潛在的生育能力，指導(dǎo)臨床診斷[4]。同時，前人對男性不育患者精子膜超微結(jié)構(gòu)畸變的報道并不多，為此進行了本實驗研究。

1 材料與方法

1.1 受試對象

結(jié)婚2年，女方生殖系統(tǒng)功能正常，男方精液常規(guī)檢查及其它生化指標正常，非梗阻性男性不育患者1例。

1.2 標本采集和處理

禁欲一周后，在室溫25～30℃的實驗室內(nèi)，由供精者取精。待精液自動液化后，緩慢注入離心管中，以2 000 r/min離心10 min，用吸管輕輕吸出精漿，沉淀精子用瓊脂糖進行預(yù)包埋，再用戊二醛固定液固定1 h后，PBS緩沖液（pH=7.2）洗滌3次（10分鐘 /次），鋨酸固定1 h，然后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，在光鏡下進行半薄定位，用甲苯胺藍染色，切超薄切片，鉛鈾雙染，透射電鏡下觀察。

1.3 觀察指標

透射電鏡下主要觀察精子的質(zhì)膜、頂體內(nèi)膜、頂體外膜等病理性改變。

2 結(jié) 果

通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該男性不育患者精液精子80%存在精子膜超微結(jié)構(gòu)不同程度的異常，并伴有多種超微結(jié)構(gòu)畸形。本實驗著重觀察了精子膜超微結(jié)構(gòu)的畸變。

2.1 質(zhì)膜的異常

在透射電鏡下可觀察到精子質(zhì)膜出現(xiàn)了病變。如精子質(zhì)膜腫脹破損（圖1A、1B），質(zhì)膜邊緣與頂體外膜融合變得模糊不清（圖1C），多處出現(xiàn)大小不等的囊泡，甚至質(zhì)膜缺失（圖1D）等。

2.2 頂體內(nèi)外層膜的異常

精子頂體內(nèi)、外層膜也都出現(xiàn)了病變。在透射電鏡下可觀察到精子頂體內(nèi)外層膜破損（圖2A、2B），雙層膜結(jié)構(gòu)呈不平行或波浪狀改變（圖2C），部分頂體內(nèi)外層膜相融合，形成大小不等的囊泡，頂體內(nèi)容物可呈現(xiàn)低電子密度（圖2D、2E），嚴重者頂體內(nèi)膜向核內(nèi)凸出，外膜彎曲外翹，導(dǎo)致頂體與核剝離（圖2F），甚者頂體內(nèi)外層膜缺失，內(nèi)容物溢出（圖2G、2H）等。

圖1 精子質(zhì)膜的異常

3 討 論

受精是一個極其復(fù)雜的生理過程，受多種因素的影響和調(diào)控[5]。在此過程中，精子膜結(jié)構(gòu)的完整性與精子新陳代謝、精子獲能及頂體反應(yīng)密切相關(guān)，在超微結(jié)構(gòu)水平探討精子膜結(jié)構(gòu)及功能完整性與男性不育的關(guān)系，對臨床男性不育癥的診斷和治療具有重要的意義[6]。

精子質(zhì)膜在受精過程中扮演著非常重要的角色。完整的質(zhì)膜可以準確地把信息從精子外傳到精子內(nèi)。而且精子在獲能過程中，通過其精子質(zhì)膜上特異性受體與周圍環(huán)境中的各種因子相互作用，從而能使精子獲得受精能力。一般認為精子頭的前半部分精子質(zhì)膜參與頂體反應(yīng)，頂體后區(qū)的精子質(zhì)膜能識別卵子，并能與卵子的細胞膜相結(jié)合。利用透射電鏡觀察到本例非梗阻性不育患者精子質(zhì)膜在超微結(jié)構(gòu)水平發(fā)生了結(jié)構(gòu)畸變。精子質(zhì)膜腫脹破損，質(zhì)膜邊緣與頂體外膜融合變得模糊不清（圖1A、1B、1C），多處出現(xiàn)大小不等的囊泡，甚至質(zhì)膜缺失（圖1D）等。這些病變不僅會直接影響到細胞的信息傳遞和物質(zhì)交換，進而影響精子的活力和新陳代謝，而且還嚴重破壞了精子膜上特異性受體和精卵識別相關(guān)位點，從而使精子獲能和頂體反應(yīng)受限，導(dǎo)致精子無法受精[7]。精子質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)完整性直接反映精子的功能狀況，是影響男性不育的重要原因。

精子發(fā)生頂體反應(yīng)是受精的關(guān)鍵[7]，而精子頂體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)是否完整在精子發(fā)生頂體反應(yīng)過程中起著重要作用[8]。人類精子頂體位于精子前端，覆蓋在精子核的前2/3 區(qū)，是一個膜結(jié)合的精子細胞特有帽狀結(jié)構(gòu)[9]。這個特殊的結(jié)構(gòu)可將與細胞膜接觸最近的頂體外膜和與精子核接觸最近的頂體內(nèi)膜隔開，當頂體反應(yīng)發(fā)生時，頂體外膜與質(zhì)膜發(fā)生多位點的融合，大量融合孔的形成使頂體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，引起頂體內(nèi)容物即十多種頂體酶釋放，這些酶類作用于卵子透明帶，協(xié)助精子進入卵細胞，從而完成受精[10]。精子頂體內(nèi)釋放的頂體酶種類與數(shù)量多少與頂體內(nèi)外層膜結(jié)構(gòu)完整程度存在密切關(guān)系[3]。利用電鏡觀察到該例非梗阻性不育患者精子頂體內(nèi)外層膜超微結(jié)構(gòu)都存在不同程度的改變，頂體內(nèi)外層膜腫脹破損（圖2A、2B），可呈不平行或波浪狀改變（圖2C），部分外膜形成大小不等的囊泡（圖2D、2E），頂體與核剝離（圖2F），嚴重者頂體內(nèi)外層膜破損，內(nèi)容物溢出（圖2G、2H）等。這些病變使得存在于頂體外膜上的誘導(dǎo)頂體反應(yīng)發(fā)生的信號通路阻斷，電壓依賴性Ca2+通道遭到破壞，導(dǎo)致質(zhì)膜溶解和頂體反應(yīng)無法發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[11]，存在于頂體內(nèi)膜上的頂體酶無法釋放[12]，使結(jié)合到卵子透明帶上的精子不能發(fā)生頂體反應(yīng)，精子因此不能穿透卵子透明帶，無法完成受精。Liu等[13]研究也證實了這一點，他研究發(fā)現(xiàn)，精子透明帶結(jié)合率低主要是精子膜缺陷，導(dǎo)致與透明帶結(jié)合和穿透障礙。

精子獲能和頂體反應(yīng)是精子最終完成受精過程中兩個主要的生理活動，對精子受精有著非常重要的意義。但是精子膜的功能障礙及結(jié)構(gòu)損傷，會降低精子獲能和精子頂體反應(yīng)，影響精子的受精能力，導(dǎo)致不育[14]。

精子膜不僅是精子活動和新陳代謝的基礎(chǔ)，也是精子獲能和精卵融合等受精過程的基礎(chǔ)，精子膜超微結(jié)構(gòu)的畸變會使精子膜功能受到影響，其功能的優(yōu)劣程度又可直接反映精子的功能狀態(tài)，因此，精子膜結(jié)構(gòu)完整性是受精過程完成必備的條件[15]。在超微結(jié)構(gòu)水平上探討精子膜結(jié)構(gòu)完整性與男性不育之間的關(guān)系，對臨床男性不育癥的診斷和治療具有重要的意義。

[1] 朱健生, 季鋼, 張玲, 等. 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)在男性不育癥的臨床應(yīng)用[J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2008, 16(9): 106-107.

[2] KATSUKI T, HARA T, UEDA K, et al. Prediction of outcomes of assisted reproduction treatment using the ionophore-induced acrosomc reaction[J]. Hum Reprod, 2005, 20(2): 469-475.

[3] SATHANANTHAN A H. Ultrastructure of human gametes, fertilization and embryos in assisted reproduction: a personal survey [J]. Micron, 2013, 44: 1-20.

[4] 熊承良, 吳明章, 劉繼紅, 等. 人類精子學(xué)[M]. 武漢: 湖北科學(xué)技術(shù)出版社, 2002: 414.

[5] WAINER R, ALBERT M, DORION A, et al. Influence of the number of motile spermtozoa inseminated and of their morphology on the success of intrauterine insemination[J]. Humam Reprod, 2004, 19(9): 2060-2065.

[6] 馬遠方, 王玉蘭, 白慧玲, 等. 精子膜功能完整性與精液各參數(shù)關(guān)系的研究[J]. 中華男科學(xué)雜志, 2002, 8(2): 103-105.

[7] MAGLI M C, CRIPPA A, MUZII L, et al. Head birefringence properties are associated with acrosome reaction, sperm motility and morphology[J]. Reprod Biomed Online, 2012, 24(3), 352-359.

[8] KASHIR J, SERMONDADE N, SIFER C, et al. Motile sperm organelle morphology evaluation-selected globozoospermic human sperm with an acrosomal bud exhibits novel patterns and higher levels of phospholipase C zeta[J]. Hum Reprod, 2012, 27 (11): 3150-3160.

[9] 郭小橋, 余波瀾, 劉見橋, 等. 精子頂體反應(yīng)及其臨床應(yīng)用價值的研究進展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志, 2013, 7(12): 5446-5448.

[10] FUKAMI K, YOSHIDA M, INOUE T, et al. Phospholipase Cdelta4 is required for Ca2+mobilization essential for acrosome reaction in spem[J]. J Cell Biol, 2003, 161(1): 79-88.

[11] 楊麥貴, 楊陽, 黃萍. 一氧化氮對人精子獲能及頂體反應(yīng)的影響[J]. 西北國防醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 26 (1): 10-12.

[12] CUI Yunhe, ZHAO Ruilan, WANG Qiang, et a1. Determination of sperm acrosin activity for evaluation of male fertility[J]. Asian J Androl , 2000, 2(3): 229-232.

[13] LIU D Y, BAKER H W. Defetive sperm-zona pellucida interaction: a major cause of failure of fertilization in clinical in-vitro fertilization[J]. Hum Reprod, 2000, 15(3): 702-708.

[14] HOWES L, JONES R. Interactions between zona pellucida glycoproteins and sperm proacrosin/acrosin during fertilization[J]. J Reprod Immunol, 2002, 53(1/2): 181-192.

[15] 岳林. 精子膜完整性與精子功能評估的相關(guān)性研究[J]. 中國計劃生育學(xué)雜志, 2005, 13(6): 363-364.

（責(zé)任編輯：劉俊華）

Study on sperm membrane ultrastructure of non-abstructive infertile male

WANG Ran1, YIN Huiying1, GUO Mingshen2, LIU Shuzhuo3, GE Shaoqin1
(1. College of Basic Medical Sciences of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. College of Life Science, Hebei University, Baoding 071000, China; 3. Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China)

Objective To explore the influence of sperm membrane ultrastructure damage on the non-obstructive infertile male. Methods After embedding the fresh semen from one case of infertile male, using transmission electron microscopy (TEM) to observe the sperm plasma membrane, outer acrosomal membrane , inner acrosomal membrane etc. Results Under the electron microscope, the defects of plasma membrane, outer acrosomal membrane and inner acrosomal membrane in the semen sperm of this infertile man were examined, with some of other abnomal spermultrastructures observed, such as defects in the sperm acrosome, nucleus, neck, mitochondrial and microtubules. Conclusion The non-obstructive male infertility is closely related to the abnormality of sperm membrane ultrastructure.

non-obstructive infertility; sperm membrane; ultrastructure

R69

A

1674-490X(2014)01-0008-05

2013-12-05

河北省自然科學(xué)基金項目（H2013201259）；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究計劃項目（2009173）；河北省計生委科研計劃項目（2009-B16）；河北省教育廳自然科學(xué)研究計劃項目（2009105）；河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)項目（2012A1004）；河北大學(xué)博士基金項目（2007B06）；河北省2013年留學(xué)人員科技活動項目；河北大學(xué)創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（2013088）

王然（1988—），女，河北石家莊人，在讀碩士，主要從事男性生殖研究。E-mail: wran2008@qq.com

葛少欽（1967—）， 男，河北保定人，教授，博士后，碩士生導(dǎo)師。 主要從事動物分子與生化及男性生殖研究。E-mail: gesq67@163.com