RP-HPLC法測定清魚油霜中維生素A含量

★ 聶秀霞 何婉敏 陳煥梅 邱玉婷

(中山市第二人民醫(yī)院 廣東 中山 528447)

清魚油霜是我院自制制劑，由魚肝油加一系列藥用基質(zhì)輔料研制而成，主要用于治療魚鱗病、急慢性皮炎濕疹、皮膚潰瘍及角化不全等，深受我院患者的好評。其主藥魚肝油系自鮫類動物Squalidae等無毒海魚肝臟中提取的一種脂肪油，在0℃左右脫去部分固體脂肪后，用精煉食用植物油、濃度較高的魚肝油或維生素A與維生素D3調(diào)節(jié)濃度制成，藥典以維生素A和D的含量為指標(biāo)作為控制其質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。由于維生素A具有共軛多烯醇的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，對氧、酸和紫外線敏感[1]，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，故以維生素A含量作為控制其質(zhì)量的指標(biāo)之一。2010版《中國藥典》采用紫外-可見分光光度法或正相高效液相色譜法測定維生素A的含量，筆者參考部分文獻(xiàn)[1,2]，采用反相高效液相色譜法測定清魚油霜中維生素A的含量，取得了一定的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1260液相色譜儀，紫外檢測器，色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm,5μm)，循環(huán)水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，電子分析天平(BS110S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥 維生素A醋酸酯(100368-201301，中國食品藥品檢定研究院)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，清魚油霜(批號：20131201、20131101、20140201)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 安捷倫1260，紫外檢測器，Eclipse XDB-C18柱(5μm，4.6×150mm)，柱溫30℃；檢測波長為325nm；進(jìn)樣量20μL，流動相為甲醇-水=95∶5；流速為1.0mL/min。

2.2 樣品的制備與處理

2.2.1 對照品溶液的配制 見2.3線性范圍中對照品溶液的配制，經(jīng)0.45μm濾膜濾過后進(jìn)樣，記錄色譜圖，圖譜見下圖1。

2.2.2 陰性對照溶液的配制 取不加清魚油的陰性清魚油霜2g，照供試品溶液配制方法處理，經(jīng)0.45μm濾膜濾過后進(jìn)樣，記錄色譜圖，圖譜見下圖2。

2.2.3 供試品溶液配制 取本品2g，加乙腈20mL，于50℃水浴2min使溶解，立即轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，放冷，經(jīng)0.45μm濾膜濾過后進(jìn)樣，記錄色譜圖，圖譜見下圖3。

圖1 維生素A醋酸酯對照圖譜

圖2 清魚油霜陰性對照

圖3 清魚油霜樣品圖譜

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表

樣品量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.21360.07680.29326103.720.21360.07680.29436105.160.21360.07680.2890898.280.21360.15370.37500105.010.21360.15370.3631297.280.21360.15370.36818100.570.21360.30740.5142497.800.21360.30740.52862102.480.21360.30740.52776102.20101.393.01

2.3 線性范圍 取維生素A對照品適量(約相當(dāng)于15mg維生素A醋酸酯)，置100mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液1mL、3mL、5mL、7mL、10mL，分別置50mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別成不同濃度的對照品溶液。精密量取對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=119.17X+0.8525，R2=1，表明對照品溶液濃度在3.07μg/mL～30.74μg/mL之間時(shí)，線性關(guān)系良好。

2.4 加樣回收試驗(yàn) 精密量取批號為20131201的已知濃度的清魚油霜2g，照供試品溶液配制方法水浴，溶解，共9份，再加入已知濃度的對照品溶液0.5mL、1mL、2mL，每個(gè)濃度平行操作3次，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，按樣品測定方法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為101.39%，RSD為3.01%，詳見表1。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批號(20131201)已知濃度的供試品2g，照2.2供試品溶液方法處理，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得維生素A醋酸酯峰面積的RSD為1.37%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下供試品溶液在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h分別進(jìn)樣一次，記錄色譜圖，維生素A醋酸酯的峰面積RSD為0.6%，說明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 改變色譜柱溫度試驗(yàn) 取供試品溶液和對照品溶液各20μL，改變色譜柱溫度為20℃、25℃、30℃，檢測波長為325nm。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以保留時(shí)間比值計(jì)算RSD。結(jié)果RSD為1.20%，表明耐用性良好。

2.8 樣品測定 分別取批號為20131201、20131101、20140201的清魚油霜樣品2g，照2.2項(xiàng)下制備，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積計(jì)算維生素A醋酸酯含量，結(jié)果見表2。

表2 三批樣品中維生素A醋酸酯含量

3 討論

2010版《中國藥典》采用紫外三點(diǎn)校正法或正相色譜法測定維生素A的含量。由于受條件限制，筆者在查閱文獻(xiàn)基礎(chǔ)上改進(jìn)提取方法，采用反相色譜法測定清魚油中維生素A的含量。由于清魚油霜為霜劑，一般采用水浴破壞相平衡后提取，筆者嘗試了加入少量水，水浴溶解后采用異丙醇提取，雜質(zhì)峰較多，分離度較差。由于乙腈具有優(yōu)良溶劑的性能，可用于合成維生素A及其中間體的溶劑，故采取乙腈為溶劑水浴提取的方法，此方法雜質(zhì)峰較少，維生素A峰型良好，理論塔板數(shù)達(dá)到4000以上，與其它物質(zhì)達(dá)到了良好的分離效果。相對于正相色譜法，此法不需要特殊的色譜柱，操作也相對簡便，可以作為測定清魚油霜中維生素A含量的方法。

[1]錢玲慧，廖佳宇，李亞妮，等.測定維生素A的三種方法比較[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2012，29(5)：43-48.

[2]陽利龍，銀雪花，祝文兵,等.HPLC測定血清中25-羥基維生素D3和維生素A及應(yīng)用[J].兒科藥學(xué)雜志，2010，16(3)：41-43.