楚鷹 岳茂興 包卿 鄭旭文 沈文明 劉政 周培根

李瑛1 卞曉星1 黃琴梅1 尹進南1 梁華平2

創(chuàng)傷性凝血病(trauma-induced coagulopathy, TIC)是世界性的治療難題，主要表現(xiàn)為嚴重創(chuàng)傷或大手術(shù)打擊下，機體出現(xiàn)的凝血障礙或紊亂[1]。創(chuàng)傷后早期死亡與無法控制的出血以及創(chuàng)傷失血后凝血病有關(guān)，特別是嚴重創(chuàng)傷患者出現(xiàn)凝血病，死亡率更高，可以達到80%左右[2]。TIC的發(fā)病機制尚未完全闡明。最新的觀點認為，TIC是由創(chuàng)傷導(dǎo)致的組織損傷和低灌注引發(fā)，活化蛋白C介導(dǎo)其發(fā)生發(fā)展，凝血系統(tǒng)各組分和因素參與其病理生理反應(yīng)過程。而傳統(tǒng)觀點中的低溫、酸中毒、血液稀釋，炎癥反應(yīng)等因素，進一步惡化了已存在的凝血功能障礙，最終導(dǎo)致創(chuàng)傷相關(guān)的凝血功能障礙[3- 4]。目前對于TIC的救治主要采用損傷控制性外科與復(fù)蘇、成分輸血、凝血因子制品、止血藥物及目標(biāo)導(dǎo)向輸血方案等。筆者在綜合治療的基礎(chǔ)上，采用20AA復(fù)方氨基酸聯(lián)用大劑量維生素B6新療法救治創(chuàng)傷性凝血功能障礙及TIC取得了比較好的效果，是救治凝血功能障礙及TIC的一種簡便實用、經(jīng)濟、有效的創(chuàng)新性療法[5]。因此，本研究通過建立大鼠創(chuàng)傷性凝血功能障礙模型，采用血栓彈力圖分析儀與傳統(tǒng)凝血功能檢測等手段，探索20AA復(fù)方氨基酸聯(lián)用大劑量維生素B6新療法對創(chuàng)傷性凝血功能障礙大鼠的治療效果，最后利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析由肝臟所合成的凝血因子的基因表達水平，探索新療法的可能作用機制。

材料與方法

一、實驗材料

1.試劑和儀器：試劑包括維生素B6注射液(0.1 g/支，2 mL)，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司(批號073121002)。20 AA復(fù)方氨基酸注射液(豐諾安注射液，50 g總氨基酸500 mL，辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號1311082164)。復(fù)方氯化鈉注射液(0.9%等滲鹽水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號B13092607)，ReverTra Ace?qPCR RT Kit(日本TOYOBO公司)，TRIzol?Reagent(美國Life Technologies公司)，Select Master Mix Q-PCR kit(美國Life Technologies公司)，PCR引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)。儀器包括TEG 5000血栓彈力圖儀(美國Haemoscope公司)，CA-1500自動凝血分析儀(日本SYSMEX公司)，WZS-50F2微量注射泵(浙江浙大醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，ABI 7500 實時熒光定量PCR(美國Life Technologies公司)，高速冷凍離心機(中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，分光光度計(上海美譜達儀器公司)，Mupid-One核酸電泳系統(tǒng)(日本Takara公司)，Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2.實驗動物及分組：雄性SD大鼠114只，體重170～200 g，江蘇大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(蘇)2013-0011。TIC大鼠模型建立實驗按隨機原則分為假手術(shù)組 (10只)，模型組(50只)，分別于造模后4 h，6 h，12 h，24 h和48 h時間點采集標(biāo)本，每個時間點10只；新療法療效實驗分為假手術(shù)組，等滲鹽水對照組，20AA復(fù)方氨基酸與維生素B6聯(lián)合治療組，共3組，每組8只；新療法作用機制實驗分為正常組(3只)、假手術(shù)組(3只)、新療法組(12只)、對照組(12只)，新療法組與對照組分別在傷后4 h，6 h，12 h及24 h四個時間點采集標(biāo)本，每個時間點3只。

二、方法

1.大鼠TIC模型的建立：實驗采用Feeney’s自由落體硬膜外撞擊法建立TBI模型，大鼠適應(yīng)性喂食3 d，禁食8 h，禁水2 h，稱重后用新鮮配置的10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后將大鼠背側(cè)固定，頭部備皮消毒后剪開頭皮，剝離骨膜，麻花鉆于矢狀縫右側(cè)2 mm，冠狀縫后4 mm處鉆直徑5 mm的圓形窗，硬腦膜保持完整。使用自由落體打擊器用40 g砝碼于25 cm處落下造成重度損傷，打擊力為1 000 g·cm。造模后縫合頭皮。指觸確定大鼠股骨位置，皮膚開口1～2 cm，暴露股骨肌肉，鈍性分離肌肉與股骨后，剪斷股骨，造成雙腿股骨骨折，縫合傷口。將大鼠翻轉(zhuǎn)固定，沿腹中線剪開皮膚，開腹造成5 cm創(chuàng)口。將內(nèi)臟推至一側(cè)后，剝離出腹主動脈，注射器抽血 2 mL(約占總血量的20%)，按壓止血后，縫合腹部傷口。

2.治療干預(yù)：模型制作完畢后，新療法治療組和等滲鹽水組大鼠，仰臥位固定，頸部切開，鈍性分離結(jié)締組織和肌肉，暴露頸靜脈，分離并插入PE-50管，固管縫合傷口后，連接微量輸液泵，輸液速度為4 mL/h。新療法治療組混合輸注豐諾安10 mL+維生素B64 mL(相當(dāng)于人體劑量：豐諾安500 mL+維生素B610 g)，等滲鹽水組輸注0.9%等滲鹽水 14 mL。假手術(shù)組大鼠，備皮消毒，頸靜脈插管后，不進行輸液操作。

3.標(biāo)本采集和檢測：造模后，使用2.5 mL注射器于腹主動脈采集血液標(biāo)本，針管預(yù)先吸取0.25 mL 3.2%枸櫞酸鈉鹽，抽血2.25 mL后，迅速將血樣注入BD藍蓋采血管中，輕輕顛倒5～10次混勻血樣。取1 mL全血標(biāo)本送武進醫(yī)院檢驗科檢測血栓彈力圖TEG，剩余血樣以3 000 r/min離心3 min，收集血漿送武進醫(yī)院檢驗科檢測凝血4項指標(biāo)。

4.TEG參數(shù)與凝血四項指標(biāo)：反應(yīng)時間(R)反映凝血因子活性，血塊生成時間(K)反映纖維蛋白交聯(lián)情況、血塊生成率(Angle)反映整體血塊形成的速率，與纖維蛋白原濃度與血小板功能狀態(tài)相關(guān)，最大寬度值(MA)反映血塊的最大強度，主要反映血小板的功能，也能反映纖維蛋白原水平。凝血酶原時間(PT)主要反映外源性凝血系統(tǒng)狀況，活化部分凝血活酶時間(APTT)主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，纖維蛋白原(FIB)主要反映纖維蛋白原的含量，凝血酶時間(TT)主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的時間。

5.RNA提取與定量PCR反應(yīng)：(1)總RNA提?。禾崛NA所用的耗材均為無RNA酶制品，玻璃器皿常規(guī)洗凈后，180℃烘烤6 h。所有試劑均用0.1%DEPC水配制。樣品勻漿化處理：剪切新鮮肝臟組織后迅速液氮冷凍保存，提取總RNA時取50～100 mg組織塊，加入1 mL TRIzol，玻璃勻漿管研磨，室溫靜置5 min后，勻漿液4℃， 以12 000 r/min離心10 min后取上清；加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min；4℃，12 000 g離心15 min后取上層水相，加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min；4℃， 12 000 g離心10 min后，移去上清，加入1 mL 75 %乙醇洗滌RNA沉淀；4℃， 7 600 g離心5 min,移去上清。空氣中干燥RNA沉淀10 min；加入50 μL 0.1%DEPC水，55℃放置10 min溶解RNA。RNA純度檢測及定量：取適量RNA稀釋后，分光光度計測定A260和A280，計算RNA濃度，瓊脂糖電泳鑒定其完整性。(2)定量PCR反應(yīng)：RNA的逆轉(zhuǎn)錄：按ReverTra Ace qPCR RT kit說明書體系進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；定量PCR反應(yīng)： 使用SYBR Select Master Mix進行real-time PCR，反應(yīng)在ABI 7 500上進行。qPCR引物設(shè)計采用NCBI提供的Primer-BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)，引物序列見表1，反應(yīng)條件為50℃ 2 min,95℃ 2 min(95℃ 15、55℃ 15、 72℃ 30)，40個循環(huán)。為確定擴增特異性，PCR產(chǎn)物均進行溶解曲線分析并進行瓊脂糖凝膠電泳。mRNA的表達水平利用2-ΔΔCt進行計算，利用管家基因GAPDH進行標(biāo)準化。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠TIC動物模型的建立

本模型通過造成大鼠顱腦損傷、雙股骨骨折，開腹及腹主動脈放血，制成大鼠多發(fā)傷模型(圖1)。傷后4 h R值降低，12 h開始升高，但與正常組相比較無統(tǒng)計學(xué)意義，48 h達到高峰，24 h，48 h與正常組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0. 05)，K值和Angle各組變化不大，與正常組相比較無統(tǒng)計學(xué)意義；MA 4 h開始延長，48 h達到高峰，24 h、48 h與正常組比

較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0. 01)。見表2。

二、新療法對模型大鼠凝血功能的影響

選擇造模后24 h作為檢測模型凝血功能變化的時間點，TEG結(jié)果顯示新療法組R值為(2.24±0.68) min，顯著低于模型組的(3.21±0.30) min(P<0.05)；新療法組Angle值(81.98±1.78)°顯著高于模型組的(79.54±2.13)°(P<0.05)。而K值與MA值，新療法組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

傳統(tǒng)凝血功能試驗，其結(jié)果與TEG結(jié)果具有相同的變化趨勢，具體反映在新療法治療組與模型組相比：凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間，凝血酶時間均縮短，而纖維蛋白原值提高，但統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明差異不顯著(P>0.05)。見表4。

表1 定量 PCR引物序列

圖1 大鼠創(chuàng)傷性凝血病動物模型制作。A、B.大鼠顱腦損傷操作；C.為大鼠頸靜脈置管；D.大鼠開腹；E.大鼠股骨骨折；F.大鼠頸靜脈輸液

組別鼠數(shù)R(min)K(min)Angle(deg)MA(mm)正常組102.20±0.600.80±0.0079.73±1.2170.40±4.004h101.83±0.410.80±0.0081.75±3.2976.73±2.336h101.90±0.360.80±0.0080.57±1.9072.63±3.0612h102.58±0.480.80±0.0080.98±1.4380.08±2.5524h103.10±0.20a0.80±0.0080.40±1.8984.03±1.93b48h103.40±0.58a0.80±0.0080.50±1.2484.58±2.10bF值4.7740.6861.0472.194P值0.030.670.3780.001

與正常組比較：aP<0.05，bP<0.01

表3 正常對照組、模型組與新療法組TEG結(jié)果比較

注：R為反應(yīng)時間，K為血塊生成時間，Angle為血塊生成率，MA為最大寬度值。與正常對照組比較:aP<0.05;與模型組比較;bP<0.05

表4 正常對照組、模型組與新療法組凝血4項結(jié)果比較

注：PT為凝血酶原時間，APTT為活化部分凝血活酶時間，F(xiàn)IB為纖維蛋白原，TT為凝血酶時間。新療法組、模型組分別與正常對照組比較：P>0.05

三、新療法對大鼠模型凝血因子基因表達的影響

1.組織提取總RNA電泳鑒定：采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性及純度(見圖2)。電泳結(jié)果顯示明顯的5 s、18 s和28 s條帶，且28 s條帶的亮度大約是18 s條帶的兩倍，說明提取的總RNA基本沒有降解。紫外分光光度計對RNA樣品進行分析的結(jié)果顯示A260/A280比值在1.8～1.9之間，表明RNA具有較高純度，滿足逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的要求。

2.凝血因子基因mRNA在肝臟組織中的表達：為驗證凝血因子基因在肝臟中的表達情況，我們利用正常大鼠的肝臟cDNA作為模板，檢測7條在肝臟中合成的凝血因子基因的表達(見圖3)。所有引物對均能檢測到預(yù)期長度的PCR產(chǎn)物，沒有非特異擴增條帶的出現(xiàn)。溶解曲線分析的結(jié)果也是單一峰圖，與PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果一致(結(jié)果未顯示)。說明所設(shè)計的PCR引物能夠用于凝血因子基因的定量檢測，且所有7條基因均在肝臟細胞中表達。

圖2肝臟組織總RNA電泳結(jié)果。注：M. DNA分子量標(biāo)準品；1.正常組；2.假手術(shù)組；3.新療法組；4.對照組

圖3凝血因子基因定量PCR擴增結(jié)果。注：M.DNA分子量標(biāo)準品；1.FⅡ；2.FⅦ；3.FⅨ；4.FⅩ；5.FⅪ；6.FⅫ；7.FⅩⅢA；8.GAPDH

3.大鼠模型凝血因子mRNA表達變化：采用定量PCR對所有處理組的凝血因子基因表達水平進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組和假手術(shù)組相比，新療法組與對照組的凝血因子基因表達明顯上調(diào)，傷后 4 h時間點基因表達上調(diào)倍率最大，隨后隨時間延長，其表達量逐漸降低。新療法組與對照組相比，凝血因子基因表達水平明顯更高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究還發(fā)現(xiàn)在所有檢測的凝血因子基因中，F(xiàn)Ⅸ上調(diào)倍率最大，而FⅪ與FⅩⅢA亞基上調(diào)倍率較小。

圖4凝血因子基因mRNA相對表達變化 注：分別為凝血因子FⅡ，F(xiàn)Ⅷ，F(xiàn)Ⅸ，F(xiàn)Ⅹ，F(xiàn)Ⅺ，F(xiàn)Ⅻ，F(xiàn)ⅩⅢA亞基;與對照組比較，aP<0.05

討 論

創(chuàng)傷是全球范圍內(nèi)中青年致死、致殘的首要原因[6]，40%的創(chuàng)傷致死患者是由出血導(dǎo)致[7]，約1/4 患者入院時即有急性TIC，病死率是非TIC 患者的4～6倍[8-9]。及早預(yù)防與糾正凝血病有利于改善創(chuàng)傷患者預(yù)后。以損失控制外科與目標(biāo)導(dǎo)向止血復(fù)蘇為主的救治方法能明顯改善創(chuàng)傷患者的凝血功能，降低病死率，但需大量輸入血液制品或重組凝血因子，同時新鮮血漿、濃縮紅細胞和血小板的最佳比例，以及重組FⅦ a與纖維蛋白原或冷沉淀的應(yīng)用指征等仍有爭議[4]。因此，探索TIC 的新療法具有重要意義。

筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，20AA 復(fù)方氨基酸聯(lián)合大劑量維生素B6也能夠救治TIC。該療法簡便易行，費用低廉，是國內(nèi)外首創(chuàng)的治療方法。20AA復(fù)方氨基酸與人體氨基酸譜基本一致，輸入后即可為機體提供底物，其含有的L- 鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間代謝物，能迅速激活肝細胞內(nèi)的尿素循環(huán)，將機體產(chǎn)生的有害CO2和氨通過尿素循環(huán)轉(zhuǎn)化為尿素排出體外，并能有效清除多器官功能障礙綜合征(MODS)時產(chǎn)生的大量有害自由基，從而減少自由基對器官的毒害，恢復(fù)肝功能正常代謝[10]。維生素B6在人體代謝中主要以磷酸吡多醛形式參與近60 多種酶反應(yīng)，多數(shù)與氨基酸代謝有關(guān)，包括轉(zhuǎn)氨基、脫羧、側(cè)鏈裂解、脫水及轉(zhuǎn)硫化作用[11]。20AA 復(fù)方氨基酰聯(lián)合維生素B6能促進肝內(nèi)酶代謝體系快速恢復(fù)，產(chǎn)生重要凝血因子，迅速恢復(fù)內(nèi)源性凝血途徑，同時配合常規(guī)治療，能有效治療凝血病大出血的瀕死患者。

傳統(tǒng)的凝血4 項指標(biāo)通常只能反映凝血早期的狀態(tài)，不能反映整個凝血過程。TEG 是基于全血的凝血功能檢測方法，其檢測時間短，能監(jiān)測凝血全過程，全面反映凝血因子、纖維蛋白活性以及血小板功能的變化，有助于早期診斷凝血功能障礙，是目前測定凝血功能的“金標(biāo)準”之一[12-13]。本研究在TIC 動物模型的基礎(chǔ)上，分別用TEG 和凝血4 項檢測新療法對大鼠凝血功能的影響，結(jié)果提示，新療法可能通過提高凝血因子活性、改善FIB 水平以提高凝血功能。盡管新療法組與模型組凝血4 項結(jié)果不存在統(tǒng)計學(xué)差異，但新療法組各項指標(biāo)均有改善，與TEG 結(jié)果具有相同的變化趨勢。本實驗中凝血4 項檢測所用的試劑盒是針對人凝血功能檢測的，有可能無法準確監(jiān)測大鼠凝血功能的改變，這也是未檢測到有統(tǒng)計學(xué)差異的原因之一。大鼠創(chuàng)傷后FIB 值升高與TEG 檢測的Angle 值變化一致，但TEG 結(jié)果與凝血4 項結(jié)果是否具有相關(guān)性，還需要進一步的實驗驗證。另外，F(xiàn)IB 在創(chuàng)傷過程中可受炎性因子的調(diào)控升高，這也是正常的生理現(xiàn)象。這些結(jié)果說明我們制備的TIC 大鼠模型可能只反映了凝血因子丟失或活性下降的特征，而血小板功能下降或纖溶亢進等特征未能得到很好的復(fù)制，所以有些TEG 參數(shù)在模型組和正常對照組之間未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。

血液凝固是一系列復(fù)雜的級聯(lián)酶促反應(yīng)過程，需要多種凝血因子的參與。目前已發(fā)現(xiàn)的凝血因子主要有14種，其中根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后順序用羅馬數(shù)字編號命名的有12種，為凝血因子Ⅰ-ⅩⅢ。這些凝血因子除FⅣ是Ca2+外，其余均為蛋白質(zhì)，且大多數(shù)在肝臟內(nèi)合成，因此肝臟是影響凝血功能的重要器官[14]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)7個在肝臟中合成的凝血因子基因，除FⅪ和FⅩⅢ A亞基外，其余均在模型致傷后4 h出現(xiàn)不同程度的mRNA表達上調(diào)，隨后上調(diào)水平逐漸下降。該結(jié)果驗證了之前所觀察到的模型先出現(xiàn)高凝狀態(tài)，后凝血功能持續(xù)降低的現(xiàn)象。而采用復(fù)合氨基酸聯(lián)用維生素B6療法的處理組，其凝血因子基因mRNA上調(diào)水平顯著高于對照組，其表達水平變化隨傷后時間延長而降低，但仍維持在較高的水平。這說明復(fù)合氨基酸聯(lián)用維生素B6療法能夠刺激大鼠模型凝血因子基因的表達，促進凝血因子在肝臟中的合成，從而改善其凝血功能。

總之，本研究通過建立與臨床基本相符的大鼠TIC模型，驗證了維生素B6聯(lián)用20AA復(fù)方氨基酸療法對TIC大鼠凝血功能的改善作用，并發(fā)現(xiàn)該新療法能夠通過提高肝臟凝血因子基因mRNA表達水平，從而達到改善凝血功能的作用。

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