謝芳，曾慶坤*，楊承劍，唐艷，農(nóng)皓如，李玲，馮玲

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

水牛乳中高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選與鑒定

謝芳，曾慶坤*，楊承劍，唐艷，農(nóng)皓如，李玲，馮玲

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

從新鮮水牛乳中篩選出三株高產(chǎn)γ-氨基丁酸（GABA）的菌株G-24、G-25、G-29。通過(guò)菌株形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定這三株菌均為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis），將其分別接種于10 mL含0.01 g/mL谷氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h，其產(chǎn)γ-氨基丁酸含量均可達(dá)60 mg/100 mL以上。

γ-氨基丁酸；乳酸菌；篩選；鑒定

從動(dòng)、植物以及微生物等自然環(huán)境中分離、篩選生物活性物質(zhì)已經(jīng)成為目前功能性食品研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于自然界中，包括微生物、植物和動(dòng)物[1]。它是脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有神經(jīng)傳遞、降低血壓、利尿以及安神等重要生理功能[2]。由于GABA有著許多重要的生理功能，而人體內(nèi)γ-氨基丁酸的合成主要有兩條途徑，一是通過(guò)人體自身合成，但是隨著年齡的增長(zhǎng)或疾病等原因，自身合成γ-氨基丁酸的能力會(huì)下降，因而不能滿足自身的需求；另一途徑是從食物中獲得，但是天然食物中γ-氨基丁酸的含量很低。因此，微生物合成γ-氨基丁酸在醫(yī)藥與食品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景[3]。

谷氨酸脫羧酶（EC 4.1.1.15）（glutamate decarboxylase，GAD）催化不可逆的α-脫羧反應(yīng)使L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸（GABA），是生物催化谷氨酸脫羧生成GABA的限速酶[4]。谷氨酸脫羧酶廣泛存在于真核生物和原核生物中，一些報(bào)道表明，乳酸菌中也存在谷氨酸脫羧酶[5-6]。目前乳酸菌大量被用于各種發(fā)酵食品，尤其是功能性乳制品當(dāng)中。因此，篩選具有合成GABA活性的乳酸菌對(duì)于開(kāi)發(fā)富含GABA的乳制品具有非常重要的意義。本研究擬從新鮮水牛乳中分離篩選具有合成GABA能力的乳酸菌并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行研究，這將為后續(xù)開(kāi)發(fā)富含GABA的功能性水牛乳制品提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茚三酮試劑：三門峽文泰化工有限公司；細(xì)菌總DNA提取試劑盒：德國(guó)Qiagen公司；谷氨酸脫羧酶基因擴(kuò)增引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；API 50 CHL菌種鑒定試劑條、API、50 CHL培養(yǎng)基、API試劑盒：法國(guó)梅里埃公司；L-谷氨酸鈉：美國(guó)Biosharp公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

乳酸菌分離培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉8 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.04 g，瓊脂14 g，吐溫-80 1 g，20 g/L CaCO3；菌種活化培養(yǎng)基為體積分?jǐn)?shù)10%的脫脂水牛乳；種子培養(yǎng)基為MRS肉湯液體培養(yǎng)基：酪蛋白酶消化物10 g，肉膏粉10 g，酵母膏粉4 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，磷酸氫二鉀2.0 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1.08 g；發(fā)酵培養(yǎng)基為含不同質(zhì)量濃度L-谷氨酸的MRS肉湯液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

日立L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本日立有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；LNG-T88臺(tái)式快速冷凍離心機(jī)：上海趙迪生物科技有限公司；HM-LNG-T83濃縮干燥器：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；尼康ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡：Nikon日本公司；BIOME TRA梯度PCR儀：德國(guó)BIOMETRA公司；SPX-150生化培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器；DYY-11B型三恒多用電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水牛乳中乳酸菌菌株分離培養(yǎng)及純化

將新鮮水牛乳進(jìn)行梯度稀釋后涂布于含20 g/L CaCO3的MRS平板上，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取肉眼可見(jiàn)、生長(zhǎng)較快、單個(gè)有溶鈣圈的菌落分離并純化，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步歸類，將革蘭氏染色陽(yáng)性、無(wú)芽孢、接觸酶陰性菌株作為進(jìn)一步篩選的乳酸菌待選菌株，并將其編號(hào)后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)GABA菌株的篩選

將保存的待選菌種，取200 μL菌液轉(zhuǎn)接到新的MRS固體平板上于37℃條件下培養(yǎng)48 h，再將單菌挑兩環(huán)接到MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h，用作發(fā)酵種子，將分離到的菌株菌液分別取1 mL到5支有9 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，搖勻，置于37℃培養(yǎng)箱活化24 h后，3支置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，?支用20%甘油管置于-20℃冰凍保存。

1.3.3 菌株鑒定

（1）菌落形態(tài)鑒定及生理生化試驗(yàn)鑒定

形態(tài)觀察及生理生化特征：將分離純化后的菌液取1 mL涂MRS平板，37℃培養(yǎng)48 h后，觀察、記錄菌落顏色、大小、邊緣生長(zhǎng)情況。取少量菌液經(jīng)革蘭氏染色后，用顯微鏡于100倍油鏡觀察并拍照。用劃線法將菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基上48 h，觀察菌株的最佳生長(zhǎng)溫度（10℃、40℃、45℃）、耐酸堿性（37℃條件下pH 4.5及pH 9.6）及耐鹽性（37℃條件下4 g/100 mL及6.5 g/100 mL NaCl）。利用葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)，過(guò)氧化氫接觸酶實(shí)驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生理生化鑒定[9-10]。

菌株的API試劑條鑒定：取適量活化后的菌液接種到API 50 CHL液體培養(yǎng)基中，搖勻，滴入API菌種鑒定試劑條中，封口，35℃條件下培養(yǎng)，記錄24 h、48 h的顏色變化，按API LAB PlusV5.0軟件鑒定。

（2）16S rDNA基因序列分析

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取DNA，以純化后的DNA為模板，正向引物為5'-CCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCG-3'，反向引物為5'-TCATATTGACCGGTATAAGTGATGCCC-3'，以PCR技術(shù)檢測(cè)乳酸菌中的谷氨酸脫羧酶基因[7]。

PCR反應(yīng)體系（總體積50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL；正、反向引物均為10 mmol/L各2.5 μL；dNTP（10 mmol/L）4 μL；基因組DNA 1.0 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；雙蒸水34.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s，55℃退火55 s，72℃延伸2 min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10 min。

1.3.4 樣品進(jìn)樣前處理

將PCR結(jié)果呈陽(yáng)性的菌株接種于10 mL含0.01 g/mL的谷氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)液經(jīng)6 000×g，20 min離心，將所得上清液加入等體積的三氯乙酸振搖5 min后移入50 mL容量瓶中，用pH 2.0的檸檬酸緩沖液稀釋至刻度，離心20 min除蛋白，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行γ-氨基丁酸定量分析[8]。

1.3.5 γ-氨基丁酸定量分析方法

用日立835-50氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行定量分析，具體程序及儀器工作條件為：分離柱：4.6mm×60mm；粒度3μm，柱填料：日立專用離子交換樹(shù)脂：日立2619#，柱溫50℃；反應(yīng)溫度135℃；光度計(jì)波長(zhǎng)570 nm；泵壓：泵1為7.8～9.8 MPa，泵2為1.5～2.0 MPa；流動(dòng)相：采用不同pH值的檸檬酸鹽緩沖液梯度淋洗分離，流速0.225mL/min；微孔濾膜。衍生劑為茚三酮試劑；運(yùn)行時(shí)間55 min；手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量：20 μL。將前處理后的樣品用微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析[9-10]。

1.3.6 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及分析

將谷氨酸脫羧酶16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行Blast分析，選擇同源性較高及已報(bào)道產(chǎn)GAD的細(xì)菌16S rDNA核苷酸序列，利用clustalx2.0進(jìn)行多重比對(duì)，然后再利用MEGA4.0軟件采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GABA菌株的分離、篩選

本試驗(yàn)共獲得100個(gè)單菌，以各單菌的DNA為模板，利用PCR技術(shù)檢測(cè)各單菌中的谷氨酸脫羧酶基因，結(jié)果顯示有12株菌的DNA中能夠擴(kuò)增出谷氨酸脫羧酶基因片段，片段長(zhǎng)度約為520 bp，結(jié)果見(jiàn)圖1（僅對(duì)菌株中DNA擴(kuò)增出氨酸脫羧酶基因片段明顯的G24、G25、G29進(jìn)行顯示）。

對(duì)PCR結(jié)果呈陽(yáng)性的12個(gè)菌株進(jìn)行GABA定量分析，結(jié)果顯示均有γ-氨基丁酸產(chǎn)生，其中產(chǎn)量最高的3個(gè)菌株結(jié)果如表1所示。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)

最終所篩選的3株菌株的鏡檢觀察結(jié)果以及平板菌落見(jiàn)圖2。由圖2可知，3株菌的菌落呈圓形，中央隆起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，乳白色。經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性，在形態(tài)上以單個(gè)或成對(duì)短桿狀菌形式出現(xiàn)。

2.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11-12]對(duì)菌株分離出的三株菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。從表2和表3可看出，G-24、G-25和G-29的各項(xiàng)檢測(cè)特征均符合文獻(xiàn)中關(guān)于乳酸乳球菌[11]的描述，初步判定這三株菌株均為乳酸乳球菌。

2.2.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

谷氨酸脫羧酶基因片段大小為520 bp，以Clostridium baratii作為外群，將菌株G24、G25、G29的16S rDNA核苷酸序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的16S rDNA核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，這三株菌株的16S rDNA核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的Lactococcus lactissubsp.lactis菌株的16S rDNA核苷酸序列的同源性達(dá)到97%以上。選擇已報(bào)道產(chǎn)GAD的細(xì)菌16S rDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3。

由圖3可知，菌株G24、G25、G29與Lactococcus lactis subsp.lactis位于同一個(gè)簇，且同源性達(dá)99%，因此鑒定該菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcus lactissubsp.lac-tis，其他產(chǎn)GAD細(xì)菌的發(fā)育關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用平板劃線、PCR法[13]以及氨基酸分析儀篩選[14]得到了12株產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株并其對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量進(jìn)行了定量分析[15]。該試驗(yàn)從生鮮水牛乳樣品中分離篩選了3株高產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株G24、G25、G29，根據(jù)這三株菌的形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，這三株菌鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis），其產(chǎn)γ-氨基丁酸含量均可達(dá)60 mg/100 mL以上。此類菌株為公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物，因其源于水牛乳中，有較強(qiáng)的GABA富集能力，在后續(xù)的研究中，有望通過(guò)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化等措施，其產(chǎn)量還可以進(jìn)一步提高，并應(yīng)用于水牛功能性乳制品的開(kāi)發(fā)利用中，為廣西特有的原生態(tài)水牛乳制品的深度開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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XIE Fang,ZENG Qingkun*,YANG Chengjian,TANG Yan,NONG Haoru,LI Ling,FENG Ling
(Guangxi Buffalo Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530001,China)

Three strains G24,G25,G29 with highγ-aminobutyric acid(γ-GABA)-producing ability were isolated from buffalo fresh milk.Based on strain morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis,the three strains were identified asLactococcus lactissubsp.lactis.Theγ-aminobutyric acid production in the MRS medium with 0.01 g/ml glutamate 10 ml was up to 60 mg/100 ml after cultivation at 37℃for 72 h.

γ-aminobutyric acid;lactic acid bacteria;screening;isolation

Q939

A

0254-5071（2015）04-0102-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.023

2015-03-09

廣西水牛研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（水?；?301007）

謝芳（1980-），女，研究實(shí)習(xí)員，本科，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぁ?/p>

*通訊作者：曾慶坤（1968-），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與技術(shù)。