俞劍燊，張鳳杰，王德良，李紅，胡健，彭金龍

（1.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海201501；2.上海石庫門釀酒有限公司，上海201501；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

釀酒工藝對黃酒中生物胺的影響

俞劍燊1，2，張鳳杰3，王德良3，李紅3，胡健1，2，彭金龍1，2

（1.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海201501；2.上海石庫門釀酒有限公司，上海201501；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

采用高效液相色譜技術(shù)，針對黃酒釀造工藝，模擬實際生產(chǎn)，分析了微生物、工藝參數(shù)和冷熱處理等對黃酒中生物胺含量的影響。結(jié)果表明，酵母Y可使生物胺總量降低，霉菌M可使生物胺總量增加，細(xì)菌除戊糖片球菌L04使生物胺總量降低外，其他細(xì)菌均可使生物胺總量增加；在培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)時間3 d，pH值為3.5，酒精體積分?jǐn)?shù)15%的條件下，生物胺總量為60.19 mg/L；煎酒使生物胺含量增加，冷凍過濾技術(shù)因有效降低酪胺含量使生物胺總量大幅降低。

黃酒；生物胺；微生物；工藝；冷熱處理

黃酒是我國歷史上最古老的酒種之一，其發(fā)酵方式為傳統(tǒng)的開放式，且多菌種參與釀造過程，這使黃酒營養(yǎng)豐富，但同時也會存在微量的有害物質(zhì)（如生物胺）。生物胺是一類含氮低分子質(zhì)量有機(jī)化合物（如色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺等）。生物胺是生物機(jī)體內(nèi)的正常活性成分，發(fā)揮重要的生理作用[1]，但積累到一定濃度時，會引起不良反應(yīng)（如頭痛、呼吸紊亂、心悸等[2-3]）。

目前，研究者已經(jīng)對黃酒中生物胺的檢測方法做了大量研究[4-8]，也有研究者對黃酒發(fā)酵液中產(chǎn)生物胺乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定與評價[9]。張鳳杰等[10]對黃酒生產(chǎn)過程中生物胺含量的變化進(jìn)行了跟蹤分析，認(rèn)為黃酒中生物胺主要來自發(fā)酵過程，并推測豐富的氨基酸不是限制發(fā)酵過程中生物胺形成的因素，而產(chǎn)生物胺的復(fù)雜菌群隨基質(zhì)條件的變化而相應(yīng)變化是生物胺形成的關(guān)鍵。

因此，本實驗采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）研究黃酒釀造工藝對黃酒中生物胺的影響，主要為微生物、不同培養(yǎng)基質(zhì)、溫度、pH值、溶解氧、時間、酒精度及酒體冷熱處理等對生物胺變化的影響，為控制和降低黃酒中生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒發(fā)酵液：上海金楓酒業(yè)股份有限公司；酵母Y、霉菌M：均從上海金楓酒業(yè)股份有限公司提供的黃酒發(fā)酵醪液中分離所得；細(xì)菌：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院實驗室保藏[11]。

化學(xué)試劑：8種單體生物胺標(biāo)樣（色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺）、18種氨基酸標(biāo)樣、1,7二氨基庚烷（內(nèi)標(biāo)）、丹磺酰氯（衍生劑）：美國Sigma公司產(chǎn)品；異硫氰酸苯酯、三乙胺，三氯甲烷、正丁醇、正己烷、三氯乙酸、丙酮、甲醇、乙腈（色譜純）：國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Perkin Elmer Series 200高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：美國Waters公司；UV-2401 PC分光光度計：尤尼克（上海）儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海恒科儀器有限公司；DC-12氮吹儀、0.45 μm針頭微孔濾膜過濾器：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；KQ520超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；L80-2離心沉淀機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PHS-3C精密pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器：上海青浦滬西儀器廠；LDZX-50KBS立式電壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DKZ系列電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；BS210S分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理方法

黃酒發(fā)酵液：從黃酒釀造車間取樣，兩層紗布滅菌后，濾紙過濾，121℃滅菌15 min保存。

1.3.2 生物胺測定方法

參照GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測定》[12]。

1.3.3 酒精度、總酸、總糖、pH值測定

參照GB/T 13662—2008《黃酒》[13]。

1.3.4 微生物在釀造過程對生物胺含量影響的測定方法

取不同時間的黃酒發(fā)酵醪，按照1.3.1所述方法處理后，接種從黃酒發(fā)酵醪液中分離出來的經(jīng)過活化的菌株（酵母Y和霉菌M及10種細(xì)菌，接種量為0.5%），30℃培養(yǎng)5 d，測定培養(yǎng)液中生物胺含量的變化，并選出使黃酒發(fā)酵醪中生物胺降低最多的菌株。

1.3.5 釀造工藝參數(shù)對生物胺含量影響的測定方法

選取上述黃酒發(fā)酵醪中生物胺降低最多的菌株為試驗菌株，以生物胺總量含量為指標(biāo)，按照4因素3水平進(jìn)行正交試驗，測定不同基質(zhì)、溫度、氧氣和時間對生物胺含量的影響。

1.3.6 冷熱處理對黃酒中生物胺含量影響的測定方法

采用煎酒、低溫長時間貯存和冷凍3種方式來處理黃酒，通過測定處理前后黃酒中的生物胺含量，分析這3種處理方式對黃酒中生物胺含量變化的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物在釀造過程對生物胺含量的影響

酵母、霉菌和細(xì)菌共同參與了黃酒釀造過程。欒同青等[14-15]研究提出黃酒中有些乳酸菌會產(chǎn)生生物胺，最新研究表明，有些植物乳桿菌會產(chǎn)生胺氧化酶，分解生物胺，研究者利用此特性來降低葡萄酒中的生物胺[16]。目前，并沒有黃酒釀造酵母和霉菌對生物胺影響的報道，葡萄酒釀造酵母是否產(chǎn)生生物胺也存在一定爭議[17-18]。為模擬工業(yè)化黃酒釀造，研究黃酒中的這些微生物最終對生物胺含量產(chǎn)生怎樣的影響，從黃酒釀造車間，按照1.3.4中所述方法測定培養(yǎng)液中生物胺含量接種酵母Y、霉菌M、細(xì)菌前后變化，結(jié)果見表1～表3。

表1和表2結(jié)果表明，酵母Y在第2天發(fā)酵醪和第4天發(fā)酵醪中培養(yǎng)后組胺有明顯降低（P＜0.05），其他胺變化不明顯；霉菌M在第2天發(fā)酵醪和第4天發(fā)酵醪中培養(yǎng)后酪胺有明顯增多（P＜0.05），尸胺有少量增加，腐胺有少量降低，其他胺變化不明顯；從生物胺總量上來看，酵母降低了生物胺總量，但霉菌使生物胺含量增加，且在第2天發(fā)酵醪中增加量最大，這是因為第2天發(fā)酵醪中霉菌更容易生長。綜上分析，酵母Y不會帶來生物胺安全性問題，但霉菌M使發(fā)酵醪液中酪胺含量升高。

表3結(jié)果表明，多數(shù)細(xì)菌使發(fā)酵醪液中生物胺含量增加，只有戊糖片球菌L04因分解酪胺而使生物胺總量明顯降低；短乳桿菌L11使生物胺含量增加最多，其次是菌株L19和L21，這三株菌同為短乳桿菌且表現(xiàn)為酪胺的顯著增加（P＜0.05）；分解組胺的菌有片球菌L04、L38，短乳桿菌L11、L19和干酪乳桿菌L45；不同菌株培養(yǎng)液中總酸含量差異顯著，這與菌株在發(fā)酵液中生長繁殖及其本身的產(chǎn)酸能力有關(guān)，片球菌、棒狀乳桿菌和芽孢桿菌的酸度變化不明顯。

2.2 釀造工藝參數(shù)對生物胺總量的影響

選擇第4天發(fā)酵醪為培養(yǎng)液，酵母Y及戊糖片球菌L04為試驗菌株，大瓶、不密封、早晚搖勻的溶氧方式，以生物胺總量為指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交試驗，結(jié)果和分析見表4。

由表4可知，影響生物胺總量順序的因素依次為B＞A＞C＞D，對于黃酒釀造來說，生物胺總量越低越好，故最佳條件為A3B1C1D3，在此條件下，做驗證試驗得出生物胺總量為60.19 mg/L。

2.3 冷熱處理對黃酒生物胺含量的影響

黃酒本身是一個成分復(fù)雜的不穩(wěn)定膠體，不同的酒樣有其穩(wěn)定的pH值和等電點，打破膠體的平衡，某些成分會析出以達(dá)到新的平衡。這是黃酒中非生物渾濁產(chǎn)生的原因，渾濁包括冷渾濁、氧化渾濁和熱渾濁，通常采用煎酒、低溫長時間貯存和冷凍處理來澄清黃酒[22-23]。因此通過試驗分析這三種處理方式對生物胺含量的影響。

煎酒前后生物胺含量變化見圖1，由圖1可知，高溫處理使生物胺含量增加，增加最多的為酪胺、其次為腐胺。這與欒同青[14]提出的“貯存溫度越高，生物胺增幅越大”類似，也可能與高溫蒸發(fā)有關(guān)。

不同年份壇裝黃酒上部清酒和酒腳中生物胺的差異見圖2。酒腳部分酪胺較上部清酒少，色胺、組胺、尸胺和腐胺在酒腳部分卻略高于上部清酒，從生物胺總量來看，壇裝黃酒上下部分沒有規(guī)律性差異。由圖2可知，酒腳部分酪胺較上部清酒少，色胺、組胺、尸胺和腐胺在酒腳部分卻略高于上部清酒，從生物胺總量來看，壇裝黃酒上下部分沒有規(guī)律性差異。

三批酒樣置于-2～0℃凍放4 d，其生物胺含量變化見圖3。冷凍過濾之后，生物胺總量降低，特別是酒樣2，生物胺降低50.82 mg/L，主要表現(xiàn)為酪胺的減少，但腐胺有少量增加，其他胺變化無規(guī)律。

由此看來，煎酒、自然沉淀、冷凍處理對每種生物胺的影響并沒有明顯規(guī)律性，這可能與不同酒體中各種生物胺的含量不同，從而使膠體狀態(tài)不同有關(guān)。但煎酒使生物胺含量增加，冷凍過濾技術(shù)因有效降低酪胺含量使生物胺總量大幅降低。

3 結(jié)論

采用HPLC技術(shù)分析了酵母、霉菌和細(xì)菌對黃酒生產(chǎn)過程中生物胺含量變化的影響；通過正交試驗探究了釀造參數(shù)對生物胺含量變化的影響；同時，分析了煎酒、自然沉淀、冷凍過濾三種工藝對生物胺含量的影響。

綜合分析，黃酒中的生物胺主要來自微生物代謝，特別是部分細(xì)菌，如短乳桿菌。釀酒工藝（如不同基質(zhì)）因影響這些微生物的生長和代謝而影響生物胺含量。另外，試驗發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌不產(chǎn)生物胺，甚至能分解部分生物胺。在不影響黃酒口味和營養(yǎng)的前提下，如何通過調(diào)整釀造工藝，使這部分優(yōu)勢菌株發(fā)揮其優(yōu)良的釀造特性，并抑制其他菌株的代謝，可以控制和降低黃酒生物胺。黃酒的機(jī)械化和現(xiàn)代化釀造是行業(yè)發(fā)展的方向，利用生物胺安全性好且發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株或菌系組合可以從根本上控制生物胺。謝廣發(fā)等[24]的研究已經(jīng)證明了將植物乳桿菌應(yīng)用于浸米過程，可降低浸米水中的生物胺。

釀造參數(shù)對總生物胺的影響試驗表明，在培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)時間3 d，pH值為3.5，酒精體積分?jǐn)?shù)15%的條件下，生物胺總量為60.19 mg/L

溫度對黃酒生物胺的影響表現(xiàn)為發(fā)酵溫度和貯存溫度[14]越高越利用生物胺的積累；高溫煎酒使生物胺含量增加；低溫冷凍使生物胺含量大幅降低。由此可見，如何控制好溫度，不僅是黃酒酒體質(zhì)量的關(guān)鍵，也是控制和降低生物胺的重要措施之一。

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YU Jianshen1,2,ZHANG Fengjie3,WANG Deliang3,LI Hong3,HU Jian1,2,PENG Jinlong1,2
(1.Shanghai Jinfeng Wine Co.,Ltd.,Shanghai 201501,China; 2.Shanghai Shikumen Wine Co.,Ltd.,Shanghai 201501,China; 3.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

In view of the Chinese rice wine brewing process,simulating the actual production,the effects of microorganism,technological parameters and cold-heat treatment on the biogenic amine content in Chinese rice wine were analyzed.The results showed that yeast Y can decrease the total biogenic amines content,while mould M can increase the total biogenic amines content.As to bacteria,in addition toPediococcus pentosaceus L04 reduced the total biogenic amines content,other bacteria all increased the total biogenic amines content.Under the condition of temperature 32℃,time 3 d,pH 3.5 and alcohol concentration 15%,the biogenic amine content was 60.19 mg/L.Wine boiling increased the content of biogenic amines,and freezing filtration technology greatly reduced the total biogenic amine by effectively reducing tyramine content.

rice wine;biogenic amine;microbes;process;cold-heat processing

TS261.4

A

0254-5071（2015）04-0123-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.028

2015-03-02

國家科技支撐計劃（2012BAK17B11）

俞劍燊（1974-），男，高級工程師，碩士，研究方向為發(fā)酵工藝與工程。