熊靜薇 毛雨 李榮榮 丁正年

布比卡因是臨床上常用的局部麻醉藥(local anesthetics，LA)，其鎮(zhèn)痛效果顯著且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因而廣泛應(yīng)用于手術(shù)中區(qū)域麻醉和手術(shù)后疼痛管理。研究證實(shí)，臨床上使用的局部麻醉藥均存在骨骼肌毒性，過(guò)量使用會(huì)引起注射部位的肌肉組織缺血壞死，肌纖維斷裂。其中，布比卡因的肌毒性最大［1］。

溶酶體是一組含有多種水解酶，并起消化作用的細(xì)胞器，專司降解各種外源性和內(nèi)源性的大分子物質(zhì)。在外傷、炎癥、缺血等病理狀態(tài)下，細(xì)胞異噬和自噬活動(dòng)增強(qiáng)，溶酶體數(shù)目增加，以適應(yīng)細(xì)胞的吞噬功能，如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［2］。但是溶酶體是否參與布比卡因所致的肌肉損傷，目前尚不清楚。為探討該問(wèn)題，我們采用小鼠成肌細(xì)胞C2C12體外培養(yǎng)模型，分析布比卡因?qū)2C12細(xì)胞溶酶體數(shù)量與活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠成肌細(xì)胞C2C12來(lái)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)。布比卡因、氯喹和α-Tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)SigmaAldrich公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清(FCS)，LysoSensor Yellow/Blue DND-160和LysoTracker Red DND-99均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Life技術(shù)公司。胰蛋白酶250為北京經(jīng)科試劑公司產(chǎn)品。MagicRed Cathepsin assay kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)Immuno-Chemistry公司。溶酶體相關(guān)膜蛋-1(LAMP-1)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組:用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)C2C12細(xì)胞，達(dá)到80%單層融合時(shí)傳代并分為2組。對(duì)照組:細(xì)胞培養(yǎng)液中不加任何藥物;布比卡因組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入600 μmol/L布比卡因刺激細(xì)胞6 h。

1.2.2 溶酶體腔pH評(píng)價(jià):LysoSensor Yellow/Blue DND-160在酸性環(huán)境中表現(xiàn)出pH依賴的熒光強(qiáng)度增加［3-4］。用24孔板培養(yǎng)C2C12細(xì)胞，布比卡因(600 μmol/L)或者氯喹(10 μmol/L)刺激細(xì)胞6 h后，加入LysoSensor試劑(5 μmol/L)孵育1 h。于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為329/440～450 nm，并拍攝圖片。

1.2.3 示蹤溶酶體:布比卡因刺激C2C12細(xì)胞6 h后，加入LysoTracker Red DND-99試劑(75 nmol/L)孵育30 min［5-8］。于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)激光強(qiáng)度，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為577/590 nm，并拍攝圖片。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)LAMP-1和Cathepsin B水平:布比卡因刺激C2C12細(xì)胞6 h后收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，一抗4℃過(guò)夜。徹底洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗4℃孵育2 h。顯影劑顯色后，暗室曝光在X光膠片上。LAMP-1和Cathepsin B表達(dá)量以LAMP-1和Cathepsin B與α-Tubulin比值表示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Cathepsin B活性分析:布比卡因刺激C2C12細(xì)胞6 h后，加入MagicRed染料避光孵育45 min。用熒光計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為590/645 nm。于熒光顯微鏡下拍攝圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 布比卡因不影響C2C12細(xì)胞溶酶體腔pHLysoSensor Yellow/Blue DND-160是一種有熒光標(biāo)記的向酸性染料，由于質(zhì)子化作用聚集于酸性細(xì)胞器，其熒光強(qiáng)度隨溶酶體腔pH的變化而改變。溶酶體腔正常呈酸性(pH為3.5～5.5)。氯喹具有堿化溶酶體的作用，因此常被用作溶酶體堿化的工具藥物。本實(shí)驗(yàn)中，氯喹處理的細(xì)胞作為溶酶體堿化陽(yáng)性對(duì)照。如圖1所示，與對(duì)照組相比，布比卡因組溶酶體熒光強(qiáng)度無(wú)變化，氯喹組熒光幾乎猝滅。本結(jié)果提示布比卡因不影響C2C12細(xì)胞的溶酶體腔pH。

圖1 布比卡因?qū)θ苊阁wpH的影響(n=3)

2.2 布比卡因增加C2C12細(xì)胞溶酶體含量Lyso-Tracker Red DND-99是一種熒光標(biāo)記的親脂性染料，具有高度選擇性，能夠透過(guò)細(xì)胞膜而積聚于活細(xì)胞溶酶體。用LysoTracker標(biāo)示溶酶體，檢測(cè)溶酶體含量，以平均熒光強(qiáng)度為單位，布比卡因組為44092±750.88，對(duì)照組為38289.75±585.01，布比卡因組的熒光單位增加15.15%(P＜0.01)，見圖2。本結(jié)果提示布比卡因增加C2C12細(xì)胞溶酶體含量。

圖2 布比卡因溶酶體含量的影響(n=4)

2.3 布比卡因增加C2C12細(xì)胞LAMP-1表達(dá)LAMP-1特異性的表達(dá)于溶酶體膜上，是溶酶體再生過(guò)程中必不可少的組成部分。以相對(duì)灰度為單位，布比卡因組蛋白表達(dá)量為1.36±0.02，對(duì)照組為1.0±0.07，布比卡因組LAMP-1蛋白表達(dá)量增加36.41%(P＜0.01)，見圖3。本結(jié)果提示布比卡因增加C2C12細(xì)胞LAMP-1表達(dá)量。

圖3 布比卡因?qū)AMP-1蛋白表達(dá)量的影響

2.4 布比卡因增強(qiáng)C2C12細(xì)胞溶酶體活性溶酶體活性與溶酶體蛋白水解酶Cathepsin B活性成正相關(guān)。以相對(duì)灰度為單位，布比卡因組Cathepsin B蛋白表達(dá)量為1.35±0.21，對(duì)照組為1.0±0.15，布比卡因組Cathepsin B蛋白表達(dá)量增加35.29%(P＜0.01)，見圖4。用MagicRed染色檢測(cè)Cathepsin B活性，如圖5所示，與對(duì)照組相比，布比卡因組熒光強(qiáng)度增加23.74%(P＜0.01)。本結(jié)果提示布比卡因增強(qiáng)C2C12細(xì)胞的溶酶體活性。

圖4 布比卡因?qū)athepsin B蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

局部麻醉藥是臨床實(shí)施局部麻醉和鎮(zhèn)痛所必需的藥物。靜脈泵鎮(zhèn)痛，硬膜外置管鎮(zhèn)痛及周圍神經(jīng)阻滯都需要局部麻醉藥參與［9-10］。關(guān)于局部麻藥所致肌毒性的分子機(jī)制的討論有很多。其中，局部麻藥引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加被認(rèn)為是引起急性細(xì)胞毒性的主要因素。局部麻藥誘導(dǎo)鈣離子從肌漿網(wǎng)釋放，同時(shí)抑制肌漿網(wǎng)對(duì)鈣的重吸收，破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)［11］。抑制線粒體功能會(huì)加重局麻藥肌毒性［12-13］，誘導(dǎo)凋亡也與局部麻藥肌毒性有關(guān)［14］。

溶酶體是一組含有多種水解酶，并起消化作用的細(xì)胞器，在蛋白質(zhì)降解中具有重要的作用。病理?xiàng)l件下，嚴(yán)重的細(xì)胞損傷會(huì)破壞溶酶體膜的滲透性，引起溶酶體酶釋放，細(xì)胞水解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在布比卡因介導(dǎo)的肌毒性中，溶酶體是否被激活是本研究關(guān)注的重點(diǎn)。

圖5 布比卡因?qū)athepsin B活性的影響(×400，n=3)

溶酶體pH與細(xì)胞的消化降解能力密切相關(guān)。溶酶體腔正常pH為3.5～5.5，這種酸性環(huán)境被認(rèn)為最有利于水解酶發(fā)揮作用。LAMP-1是位于溶酶體膜上的一類特異的蛋白質(zhì)。溶酶體水解酶是溶酶體蛋白降解系統(tǒng)中一組參與細(xì)胞代謝、肽鏈合成及蛋白降解的蛋白水解酶［15］。溶酶體水解酶分為2大類，前者包括半胱氨酸蛋白酶類如Cathepsin B、L、S，后者包括天冬氨酸蛋白酶類如Cathepsin D、E。溶酶體水解酶同時(shí)參與機(jī)體的免疫、溶骨、細(xì)胞凋亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟及發(fā)育等生理作用［16］。此外，它們還參與很多病理過(guò)程，例如在人體腫瘤中發(fā)現(xiàn)Cathepsin B上調(diào)［16］。

本研究結(jié)果提示，在小鼠成肌細(xì)胞C2C12體外培養(yǎng)模型中，布比卡因不改變?nèi)苊阁w腔pH，但布比卡因組LAMP-1與Cathepsin B表達(dá)量均較對(duì)照組顯著升高。由此表明，布比卡因不影響溶酶體腔pH，但是能增加溶酶體含量、增強(qiáng)溶酶體活性。

本研究初步發(fā)現(xiàn)布比卡因所致肌毒性與溶酶體的關(guān)系，但具體機(jī)制尚不明確。下一步研究工作將重點(diǎn)闡明自噬溶酶體途徑在局部麻醉藥肌毒性中的作用。

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