胡愛華，敖曉琳，陳 岑，蒲 彪，陳安均，姜?dú)g笑

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

乳酸菌耐酸耐膽鹽機(jī)制的研究進(jìn)展

胡愛華，敖曉琳*，陳 岑，蒲 彪，陳安均，姜?dú)g笑

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

乳酸菌作為一種優(yōu)良益生菌對(duì)人體具有重要的生理功能，它對(duì)胃腸道的耐受性是其發(fā)揮生理功能的基本前提。乳酸菌耐酸特性是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，包括雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、維持胞內(nèi)外pH平衡，細(xì)胞膜組成變化，蛋白質(zhì)、DNA損傷修復(fù)等；耐膽鹽特性主要與自身的膽鹽水解酶、表層蛋白有關(guān)。對(duì)于乳酸菌耐酸耐膽鹽機(jī)制的研究已有諸多報(bào)道，本文根據(jù)已有研究結(jié)果，對(duì)乳酸菌的耐酸耐膽鹽機(jī)制進(jìn)行綜述。

乳酸菌，耐酸，耐膽鹽，機(jī)制

近年來，隨著人們對(duì)腸道微生物與健康關(guān)系認(rèn)識(shí)的不斷深入，益生、保健等逐漸成為研究的熱點(diǎn)，乳酸菌也越來越受到人們的關(guān)注。早前，乳酸菌主要是作為發(fā)酵劑用于發(fā)酵食品生產(chǎn)，改善食品的質(zhì)地和風(fēng)味；目前乳酸菌作為一種益生元，在飼料行業(yè)、輕工、醫(yī)療保健等領(lǐng)域得到了極大的推廣和應(yīng)用。乳酸菌是一類人和動(dòng)物體內(nèi)腸道正常菌群，具有調(diào)節(jié)免疫功能、維持體內(nèi)微生態(tài)平衡等作用。乳酸菌對(duì)胃腸道的耐受力和黏附能力是其定植于人體內(nèi)環(huán)境，發(fā)揮生理功效的必要條件。

1 乳酸菌及其應(yīng)用

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性、不產(chǎn)芽孢的微生物，是益生菌中最具代表性的菌屬［1］。LAB不是細(xì)菌學(xué)的分類名稱，涉及23個(gè)屬，主要包括乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、芽胞菌屬（Bacillus species）及梭菌屬（Clostridium）等［2］。

自然界中乳酸菌種類很多，分布極廣，在乳制品、肉制品、水果、蔬菜及植物制品上都有發(fā)現(xiàn)，有些種類甚至存在于人體的口腔、胃腸中，是人體內(nèi)必不可少的功能菌群。許多研究者從傳統(tǒng)食品中分離出乳酸菌［3-5］。曾憲鵬等［6］從豬腸道中新分離出6株乳桿菌。近年來，隨著乳酸菌的特殊生理活性和營(yíng)養(yǎng)功能被不斷發(fā)現(xiàn)，有關(guān)乳酸菌的研究愈發(fā)受到重視。大量研究表明乳酸菌能維持腸道菌群微生態(tài)的平衡、促進(jìn)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、增強(qiáng)人體免疫功能，同時(shí)亦能降低血清膽固醇，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生等［7］。但乳酸菌發(fā)揮功效的前提是必須適應(yīng)人體低pH的胃酸環(huán)境和高滲透壓的膽鹽環(huán)境，所以乳酸菌作為益生菌能否耐受酸性和膽鹽環(huán)境從而保持活菌狀態(tài)是研究的重點(diǎn)。

2 乳酸菌耐酸特性

在人體眾多防御機(jī)制中，胃酸提供的強(qiáng)酸環(huán)境對(duì)微生物的影響最大。細(xì)菌從口腔進(jìn)入消化道后，絕大多數(shù)會(huì)被胃液殺死，只有少數(shù)耐酸菌能夠存活。胃液pH的大小根據(jù)個(gè)體差異、飲食結(jié)構(gòu)不同有較大的波動(dòng)，正常人胃液的pH在1.5～2.0［8］。為了發(fā)揮乳酸菌對(duì)健康的促進(jìn)作用，益生性乳酸菌必須具備耐酸特性，在胃腸消化道中保持一定的數(shù)量。

2.1 乳酸菌耐酸能力研究現(xiàn)狀

乳酸菌通常生活在兼性厭氧或厭氧條件下，本身能分泌一些有機(jī)酸，在一定程度的酸性pH下能存活。Kaboré等［9］對(duì)分離自特定發(fā)酵調(diào)味品中的乳酸菌進(jìn)行耐酸特性研究，發(fā)現(xiàn)P.acidilactici L87和P.acidilactici L169在pH 2.5的環(huán)境中存活率達(dá)96.2%。Rubio等［10］從嬰兒排泄物中分離出的3株乳酸菌能耐受pH3.0的酸性環(huán)境。王婷婷［11］、Hassanzadazar［12］都有類似研究發(fā)現(xiàn)。

2.2 乳酸菌耐酸機(jī)制研究

目前酸對(duì)微生物菌體的影響還未完全清楚，有種說法是：酸能夠通過細(xì)胞膜被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后迅速解離成不能透出細(xì)胞膜的質(zhì)子和相應(yīng)極性基團(tuán)，質(zhì)子的積累使得胞內(nèi)pH下降，從而減少了跨膜的質(zhì)子推動(dòng)力，影響了細(xì)胞多種轉(zhuǎn)膜機(jī)制的能量來源［13］。內(nèi)部的酸化條件也對(duì)蛋白質(zhì)和DNA造成永久性損害，伴隨解離過程產(chǎn)生的陰離子的大量積累，也會(huì)對(duì)細(xì)胞生理造成有害影響［14］。

乳酸菌能夠在酸性介質(zhì)中存活，源于其自身的耐酸機(jī)制。乳酸菌對(duì)酸性環(huán)境的抵制是一個(gè)復(fù)雜的過程，是多種機(jī)制交互作用的結(jié)果，其中除了自動(dòng)調(diào)節(jié)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)外，還涉及到維持胞內(nèi)外pH平衡，細(xì)胞膜組成變化，蛋白質(zhì)、DNA損傷修復(fù)等。

2.2.1 雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)乳酸菌耐酸性的影響

目前在多種乳酸菌中發(fā)現(xiàn)了與酸性調(diào)節(jié)有關(guān)聯(lián)的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（Two-component signal transduction system，TCS）。該系統(tǒng)由組氨酸蛋白激酶（Histidine protein kinase，HPK）和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（Response regulator protein，RR）兩部分組成，是細(xì)菌對(duì)各種環(huán)境信號(hào)作出反應(yīng)的重要機(jī)制之一［15］。崔艷華等［16-17］對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種L.delbrueckii subsp.Bulgaricus基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明其中一個(gè)雙組分系統(tǒng)可能與耐酸性調(diào)節(jié)有關(guān)；同時(shí)構(gòu)建了L.delbrueckii subsp.Bulgaricus基因組的一個(gè)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)突變體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌的耐酸能力明顯下降，說明該系統(tǒng)參與耐酸機(jī)制的調(diào)節(jié)。Landete等［18］構(gòu)建了缺失HPK和RR的雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因組的突變體，發(fā)現(xiàn)與野生型乳酸菌相比，突變體在L-蘋果酸中生存能力明顯減弱，進(jìn)而說明該TCS參與代謝L-蘋果酸途徑的表達(dá)。

2.2.2 維持胞內(nèi)外pH平衡對(duì)乳酸菌耐酸性的影響乳酸菌維持胞內(nèi)外pH平衡有兩種方式：通過質(zhì)子泵排除質(zhì)子和產(chǎn)生堿性物質(zhì)中和H+。這兩種方式主要通過酶參與的生化反應(yīng)來完成，如谷氨酸脫羧酶、F0F1-ATP酶、K+-ATP酶和產(chǎn)堿酶（精氨酸脫亞胺酶、脲酶）等［19-20］。

袁崢［21］對(duì)嗜酸乳桿菌La-XH 1和La-XH 2細(xì)胞膜質(zhì)子動(dòng)力酶的酶活進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明La-XH 1的H+-ATP酶和谷氨酸脫羧酶的活性均隨著pH的降低而升高，而La-XH 2中只有谷氨酸脫酸酶的酶活隨著pH的降低呈上升趨勢(shì)，說明嗜酸乳桿菌在受到酸影響時(shí)主要通過激活谷氨酸脫酸酶的活性來提高其耐酸的能力。

F0F1-ATP酶在細(xì)菌中普遍存在，該酶產(chǎn)生的分子跨膜動(dòng)力可以將細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中的H+排到胞外，從而使細(xì)胞內(nèi)的pH升高。陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶也可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH的平衡。例如K+-ATP酶通過胞內(nèi)外K+與H+的交換同樣對(duì)胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用［22］。

乳酸菌除通過質(zhì)子泵提高胞內(nèi)pH外，也可自身產(chǎn)生堿性物質(zhì)來中和H+。以精氨酸脫亞氨酸酶和脲酶為主的產(chǎn)堿酶催化底物最終產(chǎn)生的氨會(huì)中和細(xì)胞內(nèi)的H+，調(diào)節(jié)胞內(nèi)的pH，維持胞內(nèi)酸堿平衡［19］。對(duì)此，袁崢［21］有同樣的研究觀點(diǎn)。

有報(bào)道，脲酶能夠催化尿素水解為CO2和氨水，這樣可以堿化環(huán)境，提高pH［23］。

除此之外，乳酸菌胞內(nèi)的一些新陳代謝反應(yīng)如脫羧反應(yīng)和電子傳遞等對(duì)細(xì)胞內(nèi)外pH平衡的維持也起一定作用。羧基化合物在脫羧酶的催化下釋放CO2的同時(shí)，需要結(jié)合H+生成一種產(chǎn)物。ATP的生成或水解過程主要是電子轉(zhuǎn)運(yùn)的流程。當(dāng)ATP水解時(shí)，質(zhì)子在電子傳遞過程中結(jié)合最終電子受體O2生成H2O，繼而排除細(xì)胞外。菌體受到酸脅迫時(shí)，加快自身新陳代謝來適應(yīng)這種不利環(huán)境，從而保證細(xì)胞正常的生活環(huán)境。

2.2.3 細(xì)胞膜脂肪酸成分變化對(duì)乳酸菌耐酸性的影響 在酸性環(huán)境中，細(xì)胞膜尤其是其脂肪酸成分及不飽和脂肪酸數(shù)量往往會(huì)伴隨外界條件而發(fā)生一定范圍內(nèi)的改變。研究證明，細(xì)胞膜上的脂肪酸組成變化對(duì)于細(xì)胞在pH下降環(huán)境中生存起著關(guān)鍵的作用［22］。

酸脅迫誘導(dǎo)乳酸明顯增加，同時(shí)提高了細(xì)胞膜脂質(zhì)中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例，而這種比例的增加對(duì)維持細(xì)胞膜在低pH條件下的正常流動(dòng)性和生理功能是必需的［24-25］。袁崢［21］采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)嗜酸乳桿菌La-XH 1和La-XH 2的細(xì)胞膜中8種主要脂肪酸進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著pH的下降，細(xì)胞膜總的單不飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量上升了。單不飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸可以作為阻滲層降低H+對(duì)細(xì)胞膜的滲透［26］?？梢酝茰y(cè)，細(xì)胞膜組成變化，尤其是不飽和脂肪酸的增加，是乳酸菌應(yīng)對(duì)酸性環(huán)境仍維持最佳生存能力的結(jié)果。

2.2.4 受損蛋白質(zhì)、DNA修復(fù)能力對(duì)乳酸菌耐酸性的影響 細(xì)胞內(nèi)的過度酸化可引起蛋白質(zhì)變性，DNA的脫嘌呤或脫嘧啶［23］。乳酸菌對(duì)受損蛋白和DNA的修復(fù)能提高乳酸菌在低pH環(huán)境中的存活率。關(guān)于幾類乳酸菌適酸性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究表明，陪伴蛋白經(jīng)常在低pH下高表達(dá)，可能是用來修復(fù)高酸條件下產(chǎn)生的損傷蛋白，或者促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊、變性蛋白質(zhì)的復(fù)原保護(hù)以及損傷蛋白質(zhì)的排出［27-28］。由基因調(diào)控表達(dá)的酸休克蛋白能夠預(yù)防和修復(fù)酸對(duì)大分子物質(zhì)的損傷［25］。喬磊等［22］表示陪伴蛋白在適酸調(diào)節(jié)中起作用的原因之一是確保DNA損傷修復(fù)機(jī)制的正常表達(dá)。

有學(xué)者對(duì)乳酸乳球菌的研究發(fā)現(xiàn)，四種在適酸反應(yīng)中高表達(dá)的蛋白質(zhì)會(huì)在DNA損傷治療的誘導(dǎo)下表達(dá)，這表明乳酸菌適酸調(diào)節(jié)機(jī)制可能也包括DNA損傷修復(fù)機(jī)制［28］。

3 乳酸菌耐膽鹽特性

膽鹽（Bile salt）是由肝細(xì)胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而形成的鈉鹽或鉀鹽。人體中膽汁含有75%的甘氨膽酸鈉和25%的?；悄懰徕c［29］。人體小腸的膽鹽濃度一般在0.03%～0.3%，可以在細(xì)胞外產(chǎn)生高滲透壓，對(duì)菌體細(xì)胞造成影響。據(jù)了解，膽鹽的毒性作用對(duì)細(xì)胞膜和DNA都有一定程度的損傷［30］。

3.1 乳酸菌耐膽鹽現(xiàn)狀

董婷［31］、Silvia［32］、劉春紅［33］分別對(duì)酸白菜、發(fā)酵蔬菜、豬腸道中的乳酸菌進(jìn)行耐膽鹽實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌能夠耐受0.2%～0.4%的膽鹽濃度，有些菌耐受性更高。由此可見，在小腸正常膽汁濃度下，乳酸菌具有良好的抗膽汁鹽能力。

3.2 乳酸菌耐膽鹽機(jī)制

3.2.1 膽鹽水解酶對(duì)乳酸菌耐膽鹽的作用 膽鹽水解酶（Bile salt hydrolase，BSH）是微生物生長(zhǎng)、繁殖過程中產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，能水解結(jié)合態(tài)牛磺酸膽鹽和甘氨酸膽鹽，將其轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離膽酸［34］。

乳酸菌在膽鹽存在環(huán)境中可以分泌BSH來降低膽鹽對(duì)自身細(xì)胞的危害。BSH可以把結(jié)合型膽鹽分解為膽酸和游離氨基酸，而游離膽酸的溶解度較低，因此具有較高的去結(jié)合膽汁鹽能力的乳酸菌可以減少腸內(nèi)膽汁酸的重新吸收，加速膽汁酸的排泄［34-35］。在低pH的情況下膽酸以和膽固醇形成沉淀的方式排出體外。Bustos［36］研究表明，乳酸菌對(duì)甘膽酸鈉的耐受性比對(duì)?；悄懰徕c更強(qiáng)，推測(cè)可能是膽鹽水解酶和甘膽酸具有更強(qiáng)的結(jié)合性。靳志強(qiáng)等［37］做了同樣結(jié)果的研究。人體中甘膽酸鹽的含量比?；悄懰猁}的含量高很多，更利于BSH對(duì)甘膽酸鹽的解離。

有研究表明，BSH在pH 6時(shí)活力最高，而且對(duì)厭氧環(huán)境有強(qiáng)烈的依賴作用［38］。人體小腸的正常pH一般為4.8～8.2［8］，同時(shí)腸道的厭氧環(huán)境也符合膽鹽水解酶作用的條件。

3.2.2 表層蛋白對(duì)乳酸菌耐膽鹽的作用 表層蛋白（surface layer protein，SLP）是許多細(xì)菌及古生菌細(xì)胞壁表面所包被的生物活性大分子，絕大多數(shù)由蛋白質(zhì)組成，很少糖基化，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用［39］。SLP包裹在細(xì)胞膜外部，形成生理屏障，可以抵御膽鹽對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用，所以含有SLP結(jié)構(gòu)的乳酸菌具有更強(qiáng)的耐膽汁鹽能力［40］。胡斌［40］研究發(fā)現(xiàn)SLP能夠在菌體培養(yǎng)過程中重新恢復(fù)，維持細(xì)胞功能。隨著SLP的再生，菌體的耐膽鹽能力也在不斷提高。

3.2.3 自身細(xì)胞膜對(duì)乳酸菌耐膽鹽的作用 革蘭氏陽性菌自身結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞膜對(duì)大分子膽鹽的滲入起一定的阻礙作用。郭春峰［41］對(duì)細(xì)菌完整細(xì)胞和裂解細(xì)胞膽鹽解離能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌完整細(xì)胞的膽鹽解離能力均顯著低于裂解細(xì)胞的膽鹽解離能力，這說明細(xì)菌細(xì)胞膜阻礙了膽鹽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而影響胞內(nèi)BSH對(duì)膽鹽的催化效率。

3.2.4 其他理論 有學(xué)者認(rèn)為乳酸菌細(xì)胞可以直接吸收膽鹽或者膽鹽耐受性與乳酸菌自身特性無關(guān)［42］。

本實(shí)驗(yàn)組對(duì)多種乳酸菌進(jìn)行不同低pH和0.5%膽鹽濃度的聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中2株發(fā)酵乳桿菌和1株植物乳桿菌在pH 3.0的作用下，存活率均達(dá)到97%以上，具有良好的耐酸性和膽鹽耐受性。幾乎所有乳酸菌都能分泌膽鹽水解酶，而并不是所有乳酸菌都有表層蛋白，推測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵乳桿菌耐酸機(jī)制主要與胞內(nèi)外pH的平衡調(diào)節(jié)有關(guān)，植物乳桿菌耐酸機(jī)制主要與雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)；二者耐膽鹽機(jī)制主要是膽鹽水解酶的解離作用。乳酸菌對(duì)酸和膽鹽的耐受性及耐受機(jī)理具有菌株特異性，不能從微生物分類的種和屬上找到規(guī)律性，需要客觀研究和分析而論。

3.3 不同物質(zhì)對(duì)乳酸菌膽鹽耐受性的影響

葡萄糖可以顯著提高乳酸桿菌對(duì)膽鹽的耐受力，而且具有濃度效應(yīng)；不少研究者發(fā)現(xiàn)糧食作物提取物可以減少膽鹽對(duì)乳酸菌的毒性作用，且保護(hù)作用強(qiáng)于葡萄糖［43-45］。雖然目前還未完全清楚這種保護(hù)機(jī)制，但都與降低膽鹽的疏水作用有關(guān)。

板栗提取物對(duì)乳酸桿菌膽鹽耐受性的改善源于疏水肽或寡肽的抑制作用［44］。大豆黃酮和脫脂乳能顯著的提高乳酸菌耐膽鹽的能力，尤其是脫脂乳，蘇勇等推測(cè)這種作用可能與脫脂乳微粒減少了膽鹽的疏水基團(tuán)與細(xì)胞膜的接觸機(jī)會(huì)有關(guān)。pH對(duì)乳酸菌膽鹽耐受性也有一定影響，原因是pH影響膽鹽分子的離子化作用，從而改變了其對(duì)乳酸菌有毒害作用的疏水性［45］。

食物作為乳酸菌的載體，進(jìn)入人體消化道后，對(duì)胃液和腸液有一定的稀釋作用，從而緩沖胃腸液對(duì)菌體的毒害。來源不同的乳酸菌對(duì)酸和膽鹽的耐受力不相同，不同屬和同屬的不同菌株的乳酸菌耐酸耐膽鹽能力也存在差異［46-47］。來自人或動(dòng)物體內(nèi)的菌株明顯具有更好的酸、膽鹽耐受性?？梢酝茰y(cè)，人胃中來源的乳酸菌對(duì)酸的耐受能力高于對(duì)膽鹽的耐受能力，而且高于腸道來源的乳酸菌對(duì)酸的耐受能力；反之，腸道來源乳酸菌也有同樣效果。這些與其所處的環(huán)境有關(guān)，是乳酸菌對(duì)特定環(huán)境的適應(yīng)結(jié)果。

4 展望

乳酸菌作為優(yōu)良益生菌對(duì)人體具有的重要生理作用使其越來越受到消費(fèi)者和研究者的關(guān)注。乳酸菌在食用后能克服胃消化道和腸道的不利環(huán)境并在腸道定植，從而發(fā)揮其腸道保健作用。雖然乳酸菌耐酸耐膽鹽的機(jī)制尚不完全清楚，但隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，相信會(huì)有更多的機(jī)理原因被認(rèn)知，同時(shí)克隆出更多耐酸耐膽鹽的乳酸菌為人們所用。

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Research progress on mechanism of lactic acid bacteria acid and bile salt resistance

HU Ai-hua，AO Xiao-lin*，CHEN Cen，PU Biao，CHEN An-jun，JIANG Huan-xiao
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，China）

As good probiotic bacteria，LAB（Lactic acid bacteria） have important physiological function to people，and LAB could survive in human gastro-intestinal tract was the basic premise of physiological function. Theacid resistance of LAB was the result of combined action of multiple mechanisms，including TCS，outside andinside of the cell pH balance，the change of cell membrance，protein and DNA damage repair，bile salt resistanceof LAB was related to its bile salt hydrolase and surface layer protein. Acid and bile salt resistance of LAB werestudied by many reporters，and this paper summarized the mechanisms of acid and bile salt resistance of LABbasing on existed research results.

lactic acid bacteria；acid resistance；bile salt resistance；mechanism

TS201.3

A

1002-0306（2015）08-0380-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.071

2014－07－30

胡愛華（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物與發(fā)酵工程。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B04）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012NZ0002）。