張珊珊，杜震生，陳 峰，蘇 寧

(1.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳518000，2.深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院，廣東 深圳518105;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405)

周圍神經(jīng)卡壓是臨床上多發(fā)、常見(jiàn)的損傷。顯微外科手術(shù)能十分精確地解除卡壓，為卡壓神經(jīng)的再生與修復(fù)提供基礎(chǔ)。但如何保護(hù)卡壓神經(jīng)，最大程度地減輕繼發(fā)性損害，重建神經(jīng)傳導(dǎo)，當(dāng)前還無(wú)法很好解決。近年來(lái)，運(yùn)用物理療法治療周圍神經(jīng)損傷已有報(bào)道［1-4］，但治療機(jī)制仍不清楚，基于此，本課題采用經(jīng)典Mackinnon［5］大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型，采用康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法，通過(guò)對(duì)卡壓神經(jīng)CD34、VEGF 表達(dá)檢測(cè)以及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)檢測(cè)，分析康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法對(duì)卡壓周圍神經(jīng)微血管生成及功能修復(fù)的作用機(jī)制，為臨床從神經(jīng)微循環(huán)角度治療神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用雄性清潔級(jí)SD 大鼠46 只(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量230 ～250 g。

1.2 主要試劑

小鼠抗大鼠VEGF 單抗，SABC 免疫組化染色試劑盒，兔抗大鼠CD34 多克隆抗體，DAB 顯色試劑盒，均出自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

顯微手術(shù)器械:浙江寧波市成和顯微器械廠;醫(yī)用硅膠管:上海橡膠制品五廠;FS3013 德國(guó)目樂(lè)顯微鏡:德國(guó)麥迪塞姆儀器有限公司;圖像采集系統(tǒng):Image Pro Pluss 5. 01;G6805 型電針儀:上海醫(yī)療器械高科技公司。

1.4 動(dòng)物模型制作

動(dòng)物模型參照經(jīng)典Mackinnon 大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型制作。模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于同一動(dòng)物飼養(yǎng)室適宜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。在梨狀肌下緣10 mm 處，將內(nèi)徑1.0 mm、長(zhǎng)6.0 mm 的一段硅膠管縱向切開后套在這段坐骨神經(jīng)上，以7/0 無(wú)創(chuàng)線在8 倍手術(shù)顯微鏡下縫合硅膠管3 針。術(shù)后2 周，隨機(jī)選6 只，沿原切口打開，卡壓段神經(jīng)經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為中、重度脫髓鞘改變，則造模成功。造模成功后，其余40 只大鼠僅去除硅膠管，卡壓段神經(jīng)外膜不加以松解。

1.5 動(dòng)物分組

動(dòng)物模型隨機(jī)等分為4 組(n =10)。A 組(對(duì)照組):僅去除卡壓;B 組(康復(fù)訓(xùn)練組):去除卡壓后行康復(fù)訓(xùn)練;C 組(電針組):去除卡壓后行電針治療;D組(康復(fù)訓(xùn)練加電針組):去除卡壓后行康復(fù)訓(xùn)練配合電針治療。

1.6 治療方法

1.6.1 康復(fù)訓(xùn)練 手術(shù)結(jié)束后第2 周開始康復(fù)訓(xùn)練，訓(xùn)練項(xiàng)目為游泳，每天1 次，第1 天10 min，每天增加3 min，直到手術(shù)結(jié)束后第3 周增至30 min，之后不再增加維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材為止。

1.6.2 電針治療 電針治療于去除卡壓術(shù)后第2 天開始，在支架上固定，按實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)穴位定位“足三里”和“環(huán)跳穴”，用華佗牌0.25 mm、13 mm 的針灸針進(jìn)針6 mm，采用G6805 型電針儀，電針正極接在近心端，負(fù)極接在遠(yuǎn)心端，分別夾在“足三里”和“環(huán)跳”穴處的針柄上，雙向規(guī)律電脈沖，寬度0.5 ms，頻率2 Hz，穴位周圍組織達(dá)到輕度顫抖即可。治療時(shí)間為20 min，每天1 次，維持至手術(shù)結(jié)束后第3 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.7 觀察項(xiàng)目

1.7.1 整體狀態(tài) 解除卡壓手術(shù)結(jié)束后觀測(cè)大鼠的肢體、傷口恢復(fù)情況。

1.7.2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(Sciatic nerve function index，SFI)測(cè)評(píng) 參照沈?qū)幗?、朱家愷?］的方法，正常:SFI=0;完全損傷:-100;不完全損傷:-100 至0。測(cè)量時(shí)間為去除卡壓手術(shù)結(jié)束后第22 天。

1.7.3 CD34、VEGF 檢測(cè) 取卡壓神經(jīng)中段標(biāo)本石蠟切片，采用免疫組化染色，用以判定CD34、VEGF 免疫組化水平表達(dá)程度。CD34、VEGF 染色成棕黃色至深棕色為陽(yáng)性，神經(jīng)微血管密度(MVD)計(jì)算參照Weidner［7］方法。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)均錄入SPSS18.0 完成統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料均先進(jìn)行單樣本K-S 正態(tài)分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，屬正態(tài)分布且方差齊的多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，如屬于非正態(tài)分布或方差不齊的多組獨(dú)立樣本比較進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(秩和檢驗(yàn))中K 個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整體狀態(tài)

兩組大鼠均少數(shù)出現(xiàn)右爪皮膚潰瘍，但D 組潰瘍愈合程度好于B 組與C 組，A 組愈合程度最差;肌肉萎縮方面，D 組肌肉萎縮程度低于B 組與C 組，A 組肌肉萎縮最明顯;打開切口均可見(jiàn)神經(jīng)卡壓處變細(xì)，質(zhì)地變硬，與周圍組織粘連，卡壓處兩端增粗，但D 組好于B 組與C 組，A 組最差。

2.2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)測(cè)評(píng)結(jié)果

表1 提示:B、C、D 組SFI 恢復(fù)程度均大于A 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);B、C、D 組之間比較，D 組SFI 恢復(fù)程度明顯大于B 組與C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 各組大鼠SFI 比較 (±s)

表1 各組大鼠SFI 比較 (±s)

注:與A 組比較，①P ＜0.05;與B 組比較，②P ＜0.05;與C 組比較，③P ＜0.05。

組別 n SFI A 組10-28.74 ±4.00 B 組 10-21.27 ±3.80①C 組 10-21.58 ±3.65①D 組 10-15.93 ±2，68①②③

2.3 CD34 檢測(cè)結(jié)果

表2 提示:B、C、D 組再生神經(jīng)微血管數(shù)量明顯高于A 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);B、C、D 組之間比較，D 組再生神經(jīng)微血管數(shù)量明顯高于B 組與C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表2 各組大鼠CD34 表達(dá)比較 (±s)

表2 各組大鼠CD34 表達(dá)比較 (±s)

注:與A 組比較，①P ＜0.05;與B 組比較，②P ＜0.05;與C 組比較，③P ＜0.05。

組別 n CD34 A 組10 27.99 ±3.92 B 組 10 33.65 ±3.04①C 組 10 32.16 ±3.50①D 組 10 37.39 ±4.54①②③

2.4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)檢測(cè)結(jié)果

表3 提示:B、C、D 組VEGF 表達(dá)明顯高于A 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);B、C、D 組之間比較，D 組VEGF 表達(dá)明顯高于B 組與C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表3 各組大鼠VEGF 表達(dá)比較 (±s)

表3 各組大鼠VEGF 表達(dá)比較 (±s)

注:與A 組比較，①P ＜0.05;與B 組比較，②P ＜0.05;與C 組比較，③P ＜0.05。

組別 n VEGF A 組10 25.64 ±3.94 B 組 10 32.49 ±4.43①C 組 10 30.39 ±4.48①D 組 10 39.12 ±4.46①②③

3 討論

CD34 是一種跨膜細(xì)胞表面糖蛋白，是小血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞和造血祖細(xì)胞表面的標(biāo)志［8］，常用CD34 標(biāo)記新生血管，因其抗體是毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物［9］。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種作用較強(qiáng)的血管生成因子和高度特異的促血管內(nèi)皮有絲分裂因子，同時(shí)還是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。Gupta 等［10］發(fā)現(xiàn)慢性受壓神經(jīng)內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體蛋白增多，神經(jīng)內(nèi)血管數(shù)目會(huì)同時(shí)上升。在缺血性損傷情況下，Wang等［11］與Zachary［12］研究表明VEGF 能夠大幅提高血管再生。

血液供應(yīng)是神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的前提，眾所周知，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善血液供應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了神經(jīng)再生與恢復(fù)［13-16］。大鼠運(yùn)動(dòng)療法本實(shí)驗(yàn)采用游泳訓(xùn)練。一方面，水靜壓可以消除腫脹，促進(jìn)肌肉恢復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)靶器官神經(jīng)功能;另一方面，浮力作用可使身體負(fù)荷減輕，從而減輕腿部疼痛，使運(yùn)動(dòng)變得更容易，更增強(qiáng)了運(yùn)動(dòng)療效。多項(xiàng)研究顯示，在治療周圍神經(jīng)損傷、促進(jìn)神經(jīng)再生、恢復(fù)神經(jīng)功能方面，電針有較明顯優(yōu)勢(shì)［17-20］。

本研究表明電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練能夠有效促進(jìn)大鼠卡壓坐骨神經(jīng)再生，同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，這可能與神經(jīng)內(nèi)微血管再生有關(guān)。

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