梅金平,周 欣,姬文婕,馬永強(qiáng),楊國紅,郭兆增,李玉明,趙季紅

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著////研究·

基于流式細(xì)胞術(shù)的小鼠血小板聚集率檢測方法評價(jià)及川芎嗪的干預(yù)作用

梅金平1,周 欣2,姬文婕2,馬永強(qiáng)2,楊國紅2,郭兆增2,李玉明2,趙季紅2

目的評價(jià)一種新的基于流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytom etry,FCM)小鼠血小板聚集活性檢測方法,以及川芎嗪的干預(yù)作用。方法CD61-PE和CD61-FITC標(biāo)記的小鼠血小板(n=5)混合后加入ADP(終濃度20μmol/L)誘導(dǎo)血小板聚集,同時(shí)標(biāo)記兩種熒光染料的細(xì)胞群占所有血小板的百分比來評估血小板聚集功能;16只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和氯吡格雷組, FCM檢測小鼠血小板聚集功能;FCM檢測川芎嗪(TMPZ)低、中、高濃度(終濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml)和替羅非班(終濃度為5μg/ml)對小鼠血小板聚集功能的影響。結(jié)果經(jīng)ADP(終濃度20μmo l/L)誘導(dǎo)激活后含有雙色熒光標(biāo)記的細(xì)胞群即血小板聚集體明顯增多(P<0.01);FCM檢測小鼠服用氯吡格雷后其血小板聚集率顯著降低[由(19.57±1.12)%降至(8.71± 1.21)%,P<0.01];與生理鹽水組相比,TMPZ低、中、高劑量和替羅非班均能顯著降低小鼠血小板聚集率(P<0.05)。結(jié)論基于流式細(xì)胞術(shù)的小鼠血小板聚集活性檢測方法能夠準(zhǔn)確反映P2Y12受體拮抗劑、GPⅡb/Ⅲa受體阻斷劑以及川芎嗪的抗血小板活性,對于血小板相關(guān)基礎(chǔ)研究和抗血小板藥物篩選平臺具有借鑒價(jià)值。

血小板聚集;流式細(xì)胞術(shù);川芎嗪;小鼠

血小板在生理性止血、維持血管壁完整以及某些病理過程,如血栓形成、動脈粥樣硬化、不穩(wěn)定型心絞痛、腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)等過程中起著重要作用[1]。因此,血小板功能檢測對早期發(fā)現(xiàn)是否有血栓形成以及與血小板相關(guān)疾病的診斷和治療有著重要的意義[2,3]。小鼠作為模式生物之一,除了和人類有著極為相似的生理解剖結(jié)構(gòu)和胚胎發(fā)育過程,其與人類基因序列的同源性高達(dá)80%[4],因此可以利用小鼠作為動物模型來研究抗血小板藥物對機(jī)體的影響[5]。但檢測小鼠血小板功能的方法卻鮮有報(bào)道。2013年國外學(xué)者報(bào)道了一種基于流式細(xì)胞術(shù)(flow cytom etry,FCM)檢測血小板聚集率的新方法[6]。本研究對其方法進(jìn)行改進(jìn),以期評價(jià)基于FCM法檢測臨床常見抗血小板藥物以及川芎嗪(TMPZ)對小鼠血小板聚集功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量為20 g～ 30 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司;二磷酸腺苷(Adenosine acid,ADP,Sigma公司,美國);流式抗體:抗CD61-FITC、抗CD61-PE(Bio legend公司,美國);鹽酸川芎嗪(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司);注射用鹽酸替羅非班(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司);硫酸氫氯吡格雷[75 mg,賽諾非安萬特(杭州)制藥有限公司];HEPES/tyrode’s bu ffe r、酸性檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD),參照相關(guān)文獻(xiàn)配制[7];紅細(xì)胞裂解液(1× RBC美國);流式細(xì)胞儀FC 500(美國);振蕩混勻器(IKA公司,德國)。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠血小板聚集率 按照每40μL全血加入ACD 40μL,HEPES/tyrode’s bu ffer 80μL的比例制備全血稀釋液;C57BL/6J小鼠(n=5)通過頜下靜脈叢取血,靜脈血滴入EP管后迅速用微量移液器取出40μL。將稀釋的全血等分成4份,分別加入標(biāo)記為T1、T2、T3、T4的EP管,T1、T3管中分別各加入CD61-PE 0.24μL+cell staining bu ffer 5 μL,T2、T4管中分別各加入CD61-FITC 0.24μL+ cell staining bu ffer 5μL,室溫避光孵育15 min;將T1、T2中的樣品加入標(biāo)記為F1的EP管中(作為基線組);T3、T4中的樣品加標(biāo)記為F2的EP管中。F1中加入生理鹽水0.8μL,F2中加入ADP 0.8μL(終濃度為20μm ol/L),將F1、F2兩管插入渦旋器中,37℃,避光渦旋(800 r/min)10 min,以激活血小板;將500μL紅細(xì)胞裂解液加入F1、F2管中,室溫避光孵育10 min后上機(jī)檢測;上機(jī)檢測方法如下:①FITC、PE雙色熒光染料經(jīng)488 nm激發(fā)光激發(fā)后,分別產(chǎn)生波長為525 nm、572 nm的熒光,分別用Cytom ics FC 500流式細(xì)胞儀的FL1、FL2兩個(gè)通道收集熒光信號;②使用前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)二維散點(diǎn)圈定血小板門;③以CD61-FITC為橫坐標(biāo),以CD61-PE為縱坐標(biāo)建立CD61-FITC和CD61-PE散點(diǎn)圖;④檢測CD61-PE和CD61-FITC雙陽性細(xì)胞群占全部血小板的比例[Q 2/(Q 1+Q 2+Q 4)×100%,如圖1],即為血小板聚集率。每份標(biāo)本檢測15 000～20 000個(gè)血小板表面的特異熒光訊號。小鼠經(jīng)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率應(yīng)為其經(jīng)ADP誘導(dǎo)后的血小板聚集率與基線組血小板聚集率的差值。

1.2.2 FCM檢測氯吡格雷對小鼠血小板聚集率的影響 16只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和氯吡格雷組,每組8只;氯吡格雷組給予氯吡格雷鹽水混合液11.26 mg/(kg·d)灌胃[按人與動物用藥劑量換算公式:小鼠劑量(mg/kg)=9.01×成人氯吡格雷劑量(75 mg)/成人體重(60 kg)計(jì)算得出];生理鹽水組給予生理鹽水溶液0.01 ml/(g·d)灌胃。每日1次,共7 d;第7天灌胃后1 h采血,按方法1.2.1檢測小鼠血小板聚集率。

1.2.3 FCM檢測川芎嗪和替羅非班體外對小鼠血小板聚集功能的影響 40只小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、TMPZ低劑量組、TMPZ中劑量組、TMPZ高劑量組、替羅非班組,每組8只。對每組進(jìn)行血樣采集并熒光標(biāo)記,生理鹽水組、TMPZ低劑量組、TMPZ中劑量組、TMPZ高劑量組和替羅非班組分別加入生理鹽水3 μL、TMPZ 3μL(終濃度為0.5 mg/ml)、TMPZ 3μL(終濃度為1 mg/ml)、TMPZ 3μL(終濃度為2 mg/ml)和替羅非班3μL(終濃度為5μg/ml),37℃避光孵育5min后,分別用ADP(終濃度為20μg/ml)對每組進(jìn)行激活并上機(jī)檢測。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Flow Jo 7.6.1軟件分析流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果,采用G raph pad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間差別比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FCM測定小鼠血小板聚集率 FCM分析加入ADP前后的標(biāo)本(見圖1),以FSC和SSC參數(shù)設(shè)定血小板門,以CD61-FITC和CD61-PE參數(shù)分析血小板細(xì)胞群中血小板聚集情況:圖1A表示未加ADP血小板分布,Q 1細(xì)胞群為PE標(biāo)記的血小板,Q 4細(xì)胞群為FITC標(biāo)記的血小板,Q2細(xì)胞群為聚集的血小板。圖1B表示ADP活化后血小板的分布,可見加入ADP后,Q1、Q 4細(xì)胞群明顯減少,而Q2細(xì)胞群明顯增多,直觀地表明血小板發(fā)生了聚集。小鼠(n=5)經(jīng)ADP (終濃度為20μg/ml)激活后其血小板聚集率明顯上升(P<0.01)(如圖2)。

圖1 FCM檢測小鼠血小板聚集率

圖2 FCM檢測經(jīng)ADP誘導(dǎo)血小板聚集率

2.2 FCM檢測氯吡格雷體內(nèi)對小鼠血小板聚集率的影響 灌胃7 d后,與生理鹽水組相比,服用過氯吡格雷小鼠血小板聚集率顯著降低[由(19.57±1.115)%降至(8.711±1.211)%,P<0.01]。詳見圖3A。

2.3 FCM檢測TMPZ和替羅非班體外對小鼠血小板聚集率的影響 小鼠全血體外經(jīng)TMPZ和替羅非班干預(yù)后,FCM檢測其血小板聚功能明顯降低(P<0.05),并且川芎嗪對ADP(終濃度20μm o l/L)誘導(dǎo)的小鼠血小板聚集呈濃度依賴性抑制作用(如圖3B)。

圖3 FCM檢測抗血小板藥物對小鼠血小板聚集率的影響

3 討 論

隨著后基因組研究時(shí)代的到來,以及精確定點(diǎn)遺傳操作技術(shù)的建立,小鼠已成為解析人類基因功能最重要的模式生物,是研究人類疾病發(fā)病機(jī)制的理想模型,也是進(jìn)行新藥研發(fā)的一個(gè)很好載體[4]。本研究中采用熒光標(biāo)記的抗CD61特異性單克隆抗體標(biāo)記小鼠血小板,在FCM分析時(shí)能特異地識別幾乎所有的血小板[3,8]。兩種不同熒光標(biāo)記的血小板混合時(shí),在ADP的作用下,血漿纖維蛋白原和血管性假血友病因子(vWF)以“橋鏈”的作用導(dǎo)致相鄰的血小板發(fā)生聚集反應(yīng),當(dāng)FCM檢測到含有兩種熒光微粒時(shí),即為血小板聚集體(如圖1)中Q 2細(xì)胞群,通過分析Q 2細(xì)胞群占所有的血小板細(xì)胞群(Q 1+Q 2+Q 4)的比率來評估血小板聚集功能[6]。氯吡格雷為口服抗血小板藥物,需在體內(nèi)通過肝細(xì)胞P450轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用。其活性產(chǎn)物與血小板膜表面二磷酸腺苷(ADP)受體P2Y12結(jié)合,使纖維蛋白原無法與糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合,使其失去“橋鏈”作用,抑制血小板相互聚集[9,10]。替羅非班在體外即可直接通過阻止纖維蛋白原與糖蛋白Ⅱb/Ⅲa結(jié)合,而阻斷血小板的交聯(lián)及相互聚集[11,12]。本研究中經(jīng)FCM檢測小鼠服用氯吡格雷和替羅非班干預(yù)后其血小板聚集率明顯降低[3]。TMPZ系從活血化瘀中藥川芎中分離提純的一種生物堿單體,低劑量的TMPZ通過調(diào)節(jié)TXA2/PG I2平衡來影響血小板功能并呈量效關(guān)系,而高劑量的TMPZ主要是抑制血小板與其表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa互相結(jié)合而抑制血小板聚集[13]。本研究檢測結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]?；贔CM法檢測小鼠血小板聚集功能,能夠較為準(zhǔn)確地反映臨床常見抗血小板藥物以及川芎嗪的抗血小板活性。

光學(xué)比濁法(LTA)是臨床常見的檢測血小板聚集功能的方法,但此方法需要提取血小板,樣本經(jīng)離心、洗滌等過程勢必會造成人為血小板體外活化,且檢測所需的血樣本量大(3 ml～4 ml)、重復(fù)性差、檢測時(shí)間久等,這些原因嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用[14]。FCM檢測小鼠全血中血小板,使血小板更接近生理狀態(tài);所需血樣本量少(每次檢測只要40μL);無需提取血小板,整個(gè)操作過程中沒有離心、渦旋、震蕩等致使血小板體外醫(yī)源性激活的過程,防止血小板亞群丟失,在檢測過程中不會受其他種類細(xì)胞或碎片的干擾,保證了檢測的特異性[15];FCM檢測不受血液濁度影響;無放射性污染;由于FCM檢測時(shí)間短、靈敏度高,尤適用于血小板減少癥的研究[16]。但FCM也有不足之處:其檢測結(jié)果不能像聚集儀動態(tài)分析血小板聚集的過程;流式抗體以流式細(xì)胞儀較為昂貴,尚不能作為常規(guī)應(yīng)用。

本研究系統(tǒng)評價(jià)一種新的基于FCM的小鼠血小板聚集活性檢測方法,該方法能夠較為準(zhǔn)確地反映P2Y12受體拮抗劑、GPⅡb/Ⅲa受體阻斷劑和中藥川芎嗪的抗血小板作用。該方法的建立為臨床抗血栓治療、指導(dǎo)臨床用藥、篩選、開發(fā)新的抗血小板藥物等研究提供了重要依據(jù)。

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A Novel Flow Cytometr y-based Mouse Platelet Aggregation Method and Its App lication for Accessing the Effects of Tetramethylpyrazine

Mei Jinping,Zhou Xin,JiWen jie,Ma Yongqiang,Yang Guohong,Guo Zhaozeng,Li Yuming,Zhao Jihong Graduate School,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; Corresponding Author:Zhao Jihong(Tianjin Key Laboratory of Cardiovascu lar Rem odeling and Target Organ In jury,Institute of Card-i ovascular Disease and Heart Center,Ping jin Hospital,Logistics University of the Chinese Peop le’s Armed Police Forces,Tianjin 300162,China)

ObjectiveTo evaluate a novelmethod based on flow cytometry to assess mouse platelet aggregation and the effects of tetramethylpyrazine(TMPZ)on mouse platelet.MethodsPlatelets from the same mouse whole blood context(n=5)were labeled with CD61-PE or CD61-FITC,and were ana lyzed for the form ation of double-co lored aggregates by flow cytom etry afterm ixing and upon appropriate stimu lation with ADP(20μm ol/L).16 m ale C57BL/6Jm ice were randomly divided into 2 groups of norma lsa line group and clopidogrel group.The p latelet aggregation was measured by FCM after 7 days of drug administration.Whole C57BL/6J m ouse blood intervened by TMPZ was divided into 3 subgroups:low(0.5 mg/ml),m idd le(1 mg/ml)and high concentration(2 mg/ ml)and tirofiban(5μg/ml)group.Mouse plateletaggregation was tested by FCM.ResultsUpon stimulation with ADP the percentage of double-colored events increased over time and their forward scatter/side scatter positioning shifted significantly com pared with sing le p latelets(P<0.01).Mouse p late let aggregation after oral c lopidogre lwas significantly reduced from(19.57±1.12)%to (8.71±1.21)%(P<0.05).Mouse whole b lood was intervened by low,m idd le and high doses of TMPZ and tirofiban,and the m ouse p latelet aggregation rate dropped significantly com pared with that in the norm a l saline group(P<0.05).Conc lusionThe FC M-based method of evaluating p latelet aggregation can show the activities of P2Y12 recep tor antagonist,GPⅡb/Ⅲa recep tor antagonist and TMPZ,and this is potentially very relevant for both the study of p latelet and for the screening studies of the development of novelhemostatic drugs.

platelet aggregation;flow cytometry;mouse;tetramethylpyrazine

R285

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.010

1672-1349(2015)05-0585-04

2015-01-05)

(本文編輯 王雅潔)

國家自然科學(xué)基金(No.81170238);武警后勤學(xué)院院級科研基金(No.FYM 201104,WHM 201218)

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(天津300193),E-m ail:m eijinp ing2007@163.com;2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院心臟醫(yī)院,武警部隊(duì)心血管病研究所,天津市心血管重塑與靶器官損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

趙季紅,E-m ail:zjhw j@126.com