劉俊紅+楊紅霞+李子健等
摘要: 狗牙根中含有豐富的纖維素,經(jīng)纖維素酶酶解形成的還原糖通過嗜鞣管囊酵母發(fā)酵可以得到生物乙醇。以狗牙根為原料,分析嗜鞣管囊酵母發(fā)酵過程中培養(yǎng)時間、接種量、pH值、溫度等因素對乙醇得率的影響,探索最佳的發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明, pH值為5 0、溫度40 ℃、嗜鞣管囊酵母菌液(1億個/mL)接種量0 073 0 mL/g、發(fā)酵時間 60 h 為生產(chǎn)乙醇的最佳條件,此時乙醇濃度為5 146 mg/mL。
關(guān)鍵詞: 生物乙醇;嗜鞣管囊酵母;發(fā)酵;纖維素;狗牙根
中圖分類號:TQ352 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號:1002-1302(2015)08-0384 02
21世紀(jì),社會經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展,對能源的需求也越來越大,[JP+1]以煤炭為主的能源消耗結(jié)構(gòu)是我國空氣質(zhì)量不斷惡化的主要原因 [1],尋找新的替代能源是當(dāng)務(wù)之急。生物乙醇是一種新型能源,然而最初生物乙醇的生產(chǎn)主要以玉米、小麥為原料,不僅消耗大量農(nóng)產(chǎn)品,成本高,而且威脅到國家的糧食安全,影響糧食的正常供應(yīng),導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品價格上漲等連鎖反應(yīng) [2-3]。因此,第2代利用纖維素生產(chǎn)生物乙醇的技術(shù)引起較大關(guān)注 [4],這不僅可以大大緩解能源壓力,也可以避免人和能源之間的爭糧現(xiàn)象。狗牙根含有豐富的纖維素,經(jīng)稀酸預(yù)處理,在纖維素酶和木聚糖酶作用下可降解得到還原糖,接種嗜鞣管囊酵母發(fā)酵可制備生物乙醇。本試驗通過研究pH值、時間、溫度、嗜鞣管囊酵母接種量等因素對狗牙根糖化液發(fā)酵產(chǎn)生乙醇得率的影響,通過正交試驗探索狗牙根糖化液制備乙醇的最佳發(fā)酵條件,為狗牙根的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1 1 試驗材料
從河南城建學(xué)院圖書館后的山腳下采集成熟的狗牙根(Bermuda grass)植株,洗凈烘干,用粉碎機(jī)粉碎,過60目篩,密封保存,備用。
1 2 主要試劑
葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉,天津市博迪化工有限公司產(chǎn)品;酵母膏、蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;纖維素酶、木聚糖酶,和氏璧生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
1 3 試驗儀器
QE-100屹立高速中藥粉碎機(jī),武義縣屹立工具有限公司生產(chǎn);FA1004B電子天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);HWS28型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);LDZX-75KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn);PHSJ-3F pH計,上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);ZFD-A5250生化培養(yǎng)箱、HZQ-L恒溫培養(yǎng)搖床,上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)。
1 4 試驗方法
1 4 1 pH值測定 稱取狗牙根粉末1 g,加入 1%稀鹽酸,120 ℃反應(yīng)60 min;調(diào)節(jié)pH值為4 2,加入木聚糖酶和纖維素酶酶解,測還原糖的量;根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基,分別調(diào)pH值為4 0、4 5、5 0、5 5、6 0;滅菌,接種嗜鞣管囊酵母菌液(1億個/mL)0 094 9 mL/g,30 ℃搖床培養(yǎng)36 h;蒸餾測定乙醇含量。
1 4 2 溫度測定 稱取狗牙根粉末1 g分裝在試管中,加入 1%稀鹽酸,120 ℃反應(yīng)60 min;調(diào)節(jié)pH值為4 2,加入木聚糖酶和纖維素酶酶解,根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基,調(diào)pH值為5 5;滅菌,接種菌液0 094 9 mL/g,分別放于20、25、30、35、40 ℃搖床中培養(yǎng)36 h;蒸餾測定乙醇含量。
1 4 3 接種量測定 稱取狗牙根粉末1 g分裝在試管中,加入 1%稀鹽酸,120 ℃反應(yīng)60 min;調(diào)節(jié)pH值為4 2,加入木聚糖酶和纖維素酶酶解,根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基,調(diào)pH值為5 5;滅菌,分別接種菌液0 029 2、0 051 1、0 073 0、0 094 9、0 116 8 mL/g,放于30 ℃搖床中培養(yǎng)36 h;蒸餾測定乙醇含量。
1 4 4 時間測定 稱取1 g狗牙根粉末分裝在試管中,加入 1%稀鹽酸,120 ℃反應(yīng)60 min;調(diào)節(jié)pH值為4 2,加入木聚糖酶和纖維素酶酶解,根據(jù)還原糖含量配制液體培養(yǎng)基,調(diào)pH值為5 5;滅菌,接種菌液0 094 9 mL/g,放于30 ℃搖床中分別培養(yǎng)36、48、60、72、84 h;蒸餾測定乙醇含量。
1 4 5 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計4因素3水平正交試驗(表1),分析狗牙根纖維素發(fā)酵制備生物乙醇的最優(yōu)工藝條件。
2 結(jié)果與分析
2 1 單因素試驗
2 1 1 pH值對嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 由圖1可見,嗜鞣管囊酵母適于在pH值為 4 5~5 0的酸性環(huán)境中生長;pH值為5 0時,生產(chǎn)出的乙醇濃度相對較高,為 2 259 mg/mL。pH值改變不太劇烈時,酶雖未變性,但會影響酶分子活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離,從而進(jìn)一步影響酶與底物的結(jié)合或催化,使酶活性降低,也可能影響中間絡(luò)合物ES的解離狀態(tài),不利于催化生成產(chǎn)物 [5]。因此,低于或高于最適pH值,都會影響乙醇的產(chǎn)量。
2 1 2 溫度對嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 溫度能夠影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)功能及細(xì)胞結(jié)構(gòu),而細(xì)胞膜的流動性及完整性均可影響微生物的生長、繁殖和代謝 [6]。由圖2可見,溫度過低或過高都會影響細(xì)胞生長,進(jìn)而影響乙醇的得率;35 ℃時,菌株活力相對最為活躍,細(xì)胞膜的流動性達(dá)到最佳狀態(tài),此時發(fā)酵液中乙醇濃度相對較高,為4 076 mg/mL;20 ℃時,菌種的發(fā)酵能力欠佳,生長速度比較緩慢,生長周期延長,積累的代謝產(chǎn)物乙醇產(chǎn)量相對較低。2 1 3 接種量對嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 由圖3可見,隨著接種量增加,乙醇得率也逐漸升高,接種量為 0 094 9 mL/g 時,乙醇的得率相對最高,為1 02 mg/mL;接種量過低,由于沒有足夠的酵母細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn),培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)未得到充分利用,從而影響乙醇的得率。由于接種到新鮮培養(yǎng)液的種子細(xì)胞,一時缺乏分解或催化有關(guān)底物的酶或輔酶,或是缺乏充足的中間代謝物,在實際菌種生長過程中會產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成有關(guān)的中間代謝物 [7-8],這就需要有一段用于適應(yīng)的時間,出現(xiàn)延滯期。在發(fā)酵工業(yè)中,為縮短延滯期以縮短生產(chǎn)周期,通常都會采用較大的接種量。但是,如果接種量過高,培養(yǎng)基既要滿足菌體生長,又要用于生產(chǎn)乙醇,反而會使乙醇的產(chǎn)量下降。2 1 4 發(fā)酵時間對嗜鞣管囊酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響 菌種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇需要一個合理的發(fā)酵周期,發(fā)酵時間直接影響著乙醇的產(chǎn)量。由圖4可見,嗜鞣管囊酵母發(fā)酵培養(yǎng)的最佳時間為60 h,此時,發(fā)酵液中乙醇濃度為相對最高,為 2 442 mg/mL;發(fā)酵72 h時,發(fā)酵液中乙醇濃度有所降低,這是因為嗜鞣管囊酵母發(fā)酵初期以發(fā)酵液中的葡萄糖為碳源,酵母不斷代謝葡萄糖發(fā)酵成乙醇,而管囊酵母同化乙醇的能力很強(qiáng) [9];發(fā)酵超過72 h,發(fā)酵液中的葡萄糖含量減少,酵母可能開始利用乙醇為碳源來維持自身的生長和繁殖。endprint
2 2 正交試驗與工藝優(yōu)化
由表2可見,影響乙醇產(chǎn)物得率的最關(guān)鍵因素是發(fā)酵溫度;嗜鞣管囊酵母發(fā)酵狗牙根生成乙醇的最佳條件為A2B3C1D2,即pH值為5 0、溫度40 ℃、接種量0 073 0 mL/g、時間60 h,此時,乙醇濃度最高,為5 146 mg/mL。
3 討論
目前,纖維素生產(chǎn)乙醇的研究主要集中于預(yù)處理方法的選擇、工藝的優(yōu)化、酶水解成本的降低及乙醇轉(zhuǎn)化率的提高。利用預(yù)處理和雙酶降解纖維素后的還原糖為原料,接種單一的嗜鞣管囊酵母發(fā)酵制備乙醇,乙醇的得率往往相對較低,而多菌種混合發(fā)酵可充分利用培養(yǎng)基中的有效成分,提高乙醇的得率,這為進(jìn)一步提高產(chǎn)量提供了依據(jù) [10]。
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