魏美連 榮瑗瑗 王瑩 康維強(qiáng) 宋達(dá)琳

基礎(chǔ)研究

血管平滑肌細(xì)胞前膠原α-多肽增齡性改變影響血管重構(gòu)的機(jī)制初探

魏美連 榮瑗瑗 王瑩 康維強(qiáng) 宋達(dá)琳

目的 探討增齡影響下大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）前膠原α-多肽的改變及潛在的可能機(jī)制。方法 通過(guò)對(duì)剛出生的幼齡（對(duì)照組）和9個(gè)月成年（成年組）健康雄性Wistar大鼠的胸腹主動(dòng)脈進(jìn)行體外試驗(yàn)，采用RT-PCR半定量和定量技術(shù)檢測(cè)VSMCⅠ型和Ⅲ型前膠原α-多肽mRNA，通過(guò)VG染色、Western blot及ELISA方法檢測(cè)前膠原α-多肽蛋白表達(dá)。結(jié)果 RT-PCR半定量結(jié)果顯示，Ⅰ型前膠原α-多肽mRNA對(duì)照組為76.62±1.05，成年組為78.37±2.42，兩組比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；Ⅲ型前膠原α-多肽mRNA對(duì)照組為105.4±2.66，成年組為123.1±3.81，兩組比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Ⅰ型前膠原α-多肽mRNA定量成年組為4.63±1.03，但與對(duì)照組3.13±0.54比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.05）；Ⅲ型前膠原α-多肽mRNA定量成年組為7.68±0.63，與對(duì)照組6.86±0.41比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Ⅰ型前膠原α-多肽蛋白表達(dá)在成年組為0.1±0.03，對(duì)照組為0.06±0.03，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅲ型前膠原α-多肽蛋白表達(dá)在成年組為0.58±0.06，對(duì)照組為0.4±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 前膠原α-多肽增齡性變化的調(diào)節(jié)通路是老化性血管重構(gòu)的分子機(jī)制之一。

增齡； 血管重構(gòu)； 血管平滑肌細(xì)胞； 前膠原α-多肽

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇剛出生（對(duì)照組）和9個(gè)月（成年組）的雄性Wistar大鼠各12只，購(gòu)于青島醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)。所有試驗(yàn)操作均得到青島市市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC培養(yǎng)、傳代和鑒定實(shí)驗(yàn) 分離大鼠胸腹主動(dòng)脈在Hank′s液中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入無(wú)菌室；除血凝塊、血管外膜層、小分支和內(nèi)膜層內(nèi)皮細(xì)胞；1 mm血管組織至20%胎牛血清的DMEM中貼壁培養(yǎng)3～5 d，組織塊的間距為0.5 cm。0.25%胰蛋白酶消化，使細(xì)胞脫離消化液，在倒置纖微鏡下觀察。免疫組化鑒定：特異性鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，采用SP法對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。鏡下觀察到細(xì)胞爬片，可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)大量平行陽(yáng)性染色，胞核不著色；所有細(xì)胞染色，結(jié)果均為陽(yáng)性。

1.2.2 大鼠VSMC前膠原α-多肽mRNA RT-PCR半定量分析和Real-time定量分析 取大鼠胸腹主動(dòng)脈 VSMC，TRIzol（Invitrogen）提取總 RNA。RTPCR半定量檢測(cè)Ⅰ型和Ⅲ型前膠原α-多肽（Col-1α和Col-3α）mRNA的變化。PCR半定量按如下程序進(jìn)行：95 ℃，3 min；94 ℃，20 s；55 ℃，20 s；72 ℃，20 s；32個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。引物相見(jiàn)表1。

Real-time定量分析反應(yīng)混合物：2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μl，F(xiàn)orward Primer（2 μm，微 米）0.5 μl，Reverse Primer （2 μm，） 0.5 μl，RNase-free ddH2O 3.5 μl，cDNA 第一鏈模板 0.5 μl。程序進(jìn)行熒光定量反應(yīng)：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，20 s；58 ℃，20 s；72 ℃，20 s；40 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 大鼠胸腹主動(dòng)脈前膠原α-多肽蛋白表達(dá)的VG染色、IHC和Western blot檢測(cè) 取大鼠新鮮胸腹腔主動(dòng)脈一段，Tissue TekRO.C.T.Compound冰凍切片包埋劑包埋，直接凍結(jié)切片；乙醇固定后蘇木素染細(xì)胞核；沖洗后VG染色液染色；鏡檢，膠原纖維紅色、肌纖維黃色、胞核藍(lán)色。組織切片依次封閉、一抗、抗小鼠生物素化二抗和HRP標(biāo)記鏈親和素，進(jìn)行IHC檢測(cè)。

Western blot蛋白定量：胸腹主動(dòng)脈加入裂解液，勻漿，冰孵并離心，收集上清液，蛋白濃度用BCA法（Bio-Rad公司）測(cè)定。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（MBI）。使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，將凝膠上蛋白印記至硝酸纖維素膜（NC膜）。麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。分別在一抗和二抗結(jié)合后，使用ECL類試劑檢測(cè)蛋白。成像系統(tǒng)采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原α-多肽mRNA實(shí)時(shí)熒光PCR半定量用引物

1.2.4 大鼠胸腹主動(dòng)脈前膠原ELISA定量分析 取兩組Wistar大鼠新鮮胸腹主動(dòng)脈一段稱重（固定重量），組織勻漿后加入5 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，2500 rpm離心5 min，取上清，分裝于0.5 ml EP管中并置于-20℃保存。統(tǒng)一采用大鼠Ⅰ型和Ⅲ型前膠原ELISA試劑盒（PCⅠELISA kit，PCⅢ ELISA kit）定量檢測(cè)前膠原濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠VSMC前膠原α-多肽mRNA RT-PCR半定量分析 Ⅰ型和Ⅲ型前膠原α-多肽mRNA在兩組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；VSMC前膠原α-多肽mRNA Real-time定量結(jié)果顯示，Ⅰ型前膠原α-多肽mRNA在成年組升高，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.05）；Ⅲ型前膠原α-多肽mRNA兩組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠VSMC前膠原α-多肽mRNA半定量及定量的比較（±s）

表2 兩組大鼠VSMC前膠原α-多肽mRNA半定量及定量的比較（±s）

組別 例數(shù) Col-1α mRNA Col-3α mRNA半定量 定量 半定量 定量對(duì)照組 12 76.62±1.05 3.13±0.54 105.40±2.66 6.86±0.41成年組 12 78.37±2.42 4.63±1.03 123.10±3.81 7.68±0.63 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2．2 前膠原α-多肽蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)VG染色前膠原α-多肽蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，兩類前膠原α-多肽蛋白在老齡組顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 大鼠胸腹主動(dòng)脈前膠原ELISA檢測(cè) 成年組與對(duì)照組比較，ELISA顯示 OD值升高，PCⅠ（76.0±5.2）ng/ml比（64.0±4.2）ng/ml，PCⅢ（78.0±5.3）ng/ml比（66.0±4.3）ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

本研究表明，大鼠VMSC的Ⅰ型和Ⅲ型前膠原α-多肽表達(dá)存在增齡性改變；但是這兩個(gè)年齡組尚未出現(xiàn)Ⅰ型和Ⅲ型前膠原α-多肽mRNA水平的差異，提示前膠原α-多肽增齡性變化的調(diào)節(jié)通路可能是血管重構(gòu)的分子機(jī)制之一。

我們前期曾通過(guò)臨床研究創(chuàng)新性地提出年齡是影響血管重構(gòu)的獨(dú)立因素，并首次提出血管重構(gòu)的增齡機(jī)制[6]，還認(rèn)為探討年齡影響血管重構(gòu)的分子基礎(chǔ)在于VSMC和其分泌膠原的增齡性調(diào)節(jié)機(jī)制。

通常認(rèn)為，VSMC決定動(dòng)脈管壁的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，涉及生長(zhǎng)、發(fā)育、重構(gòu)及修復(fù)[15]；VSMC的增殖及遷移是血管重構(gòu)過(guò)程中的核心過(guò)程[16]。VSMC可以合成及分泌膠原，它是動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)最豐富的成分。動(dòng)脈壁膠原的增加不僅導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)的改變，還增加了動(dòng)脈的硬度，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展及心血管疾病的主要原因[17-19]。血管壁的平衡性、穩(wěn)定性及柔軟度取決于兩種蛋白——膠原蛋白及彈力蛋白，而彈力蛋白性能的顯著變化及膠原合成的刺激與年齡有關(guān)[4]。主動(dòng)脈包括不同的膠原類型，主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成[20]。由于Ⅰ型前膠原和Ⅲ型前膠原是成熟膠原的前體分子，因此它們的水平可以反映膠原合成的程度[21,22]。

膠原生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及眾多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的步驟。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在核糖體上按照特定的膠原mRNA的堿基序列翻譯成不成熟前膠原α-多肽后的第一個(gè)步驟就是導(dǎo)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔經(jīng)過(guò)一系列的翻譯后修飾合成了前膠原分子[23]。見(jiàn)圖3。

膠原與其他多亞基蛋白的裝配和分泌的模式相同。細(xì)胞攝取合成肽鏈所需的氨基酸，包括脯氨酸、賴氨酸和甘氨酸，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上按照特定的膠原mRNA的堿基序列翻譯，并在羥化酶的作用下，將肽鏈中的脯氨酸和賴氨酸羥化；經(jīng)羥化后3條前膠原α-多肽鏈互相纏繞成繩索狀的前膠原蛋白分子。溶解狀態(tài)的前膠原蛋白分子兩端未纏繞呈球狀構(gòu)型，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)或轉(zhuǎn)移到高爾基復(fù)合體內(nèi)加入糖基后分泌到細(xì)胞外，再由前膠原轉(zhuǎn)變?yōu)樵z原分子，最終聚集和共價(jià)形成膠原微纖維，進(jìn)而聚合形成膠原纖維和膠原束[24,25]。見(jiàn)圖4。

本研究?jī)山M不同年齡大鼠的前膠原α-多肽基因轉(zhuǎn)錄未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如何解釋這一現(xiàn)象，主要在于老化影響DNA既存在損傷又可以被修復(fù)[26]。新的觀點(diǎn)還認(rèn)為，細(xì)胞衰老是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)發(fā)展的多步驟過(guò)程，而從老化的速度來(lái)看存在著急性與慢性之分[27]。因此，本試驗(yàn)的年齡分組可能不完全模擬衰老的過(guò)程，而在某一年齡段內(nèi)基因水平可能不依賴增齡而改變。

前膠原α-多肽增齡性改變的調(diào)節(jié)機(jī)制可能主要來(lái)自核糖體翻譯，而關(guān)于老化過(guò)程中核糖體作用的研究確實(shí)也是當(dāng)前學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)。在核糖體按照特定的mRNA的堿基序列翻譯成不成熟前膠原α-多肽的過(guò)程中，還顯示了寡核糖體RNA（rRNA）核苷酸的修飾功能，這導(dǎo)致了生物機(jī)能的改變和依賴rRNA調(diào)節(jié)的翻譯改變壽命和應(yīng)激反應(yīng)[28]。有研究表明，核糖體亞單位本身指導(dǎo)監(jiān)管功能基因組的翻譯，調(diào)節(jié)特定的mRNA結(jié)合和組件之間的交互翻譯；翻譯前mRNA特異性地結(jié)合VSMC的40 s核糖體亞單位可能選擇地影響多肽鏈的生成率[29]。

然而，關(guān)于增齡影響VSMC前膠原α-多肽基因轉(zhuǎn)錄和其蛋白表達(dá)的機(jī)制爭(zhēng)論激烈。線粒體能量代謝及氧化應(yīng)激一直是研究的核心。新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示[30]，過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子PGC-1α/β信號(hào)通路在老化過(guò)程中扮演重要角色，老化調(diào)節(jié)PGC-1α/β信號(hào)通路影響線粒體與細(xì)胞核之間的通訊，導(dǎo)致線粒體核蛋白體介導(dǎo)的多肽合成及將線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）改變，但細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄未見(jiàn)明顯的年齡依賴性改變。

本研究初步探討了血管平滑肌細(xì)胞前膠原α-多肽變化影響增齡性血管重構(gòu)的機(jī)制，從分子水平揭示增齡性血管重構(gòu)的關(guān)鍵，為老化機(jī)制理論的深入探索奠定基礎(chǔ)，并為未來(lái)抗血管老化和動(dòng)脈硬化的研究提供依據(jù)。

圖1 不同年齡組大鼠胸腹主動(dòng)脈前膠原α-多肽蛋白表達(dá)（VG染色×100）

圖2 不同年齡組大鼠前膠原α-多肽蛋白Western blot檢測(cè)

圖3 前膠原α-多肽的翻譯過(guò)程示意圖

圖4 膠原合成過(guò)程示意圖

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Mechanism on age-related changes of procollagen alpha polypeptide effecting vascular remodeling in rat vascular smooth muscle cell

WEI Mei-lian＊，RONG Yuan-yuan，WANG Ying，et al.＊Profession of Geriatric Cardiology，the Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071，China

SONG Da-lin，E-mail：dsong55cn@aliyun.com

Objective To investigate the age-related changes of procollagen alpha polypeptide gene mRNA and protein expression in rat vascular smooth muscle cell（VSMC）and the possible underlying mechanisms.Methods For in vitro culture of VSMC from thoracoabdominal aorta in neonate and 9 months old healthy male Wistar rats，procollagen alpha polypeptide mRNA and procollagen alpha polypeptide protein expression were detected，using of RT-PCR，VG staining，Western blot and ELISA methods.Results Real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）Semi quantitative displays that there was no significant difference between the two groups of typeⅠ and typeⅢ collagen α polypeptide chain mRNA.RT-PCR quantitative result displays that type Ⅰ collagen α polypeptide chain mRNA increased in adult group，but no significant difference（P=0.05），there was no significant difference between the two groups of type Ⅲ collagen α polypeptide chain mRNA（P＞0.05）.Both typeⅠand typeⅢ procollagen alpha polypeptide protein expression were increased significantly in adult group as compared with the young group（P＜0.05）.Conclusion Regulatory pathway on age-related changes of procollagen al－pha polypeptide is one of the molecular mechanisms of aging vascular remodeling.

Aging； Vascular remodeling； Vascular smooth muscle cell； Procollagen alpha polypeptide血管重構(gòu)與動(dòng)脈粥樣硬化、支架內(nèi)再狹窄、靜脈瓣膜疾病及移植相關(guān)的靜脈病變有關(guān)。血管重構(gòu)包括動(dòng)脈收縮或擴(kuò)張時(shí)動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的改變[1]，與持續(xù)血流剪切力的變化[2,3]及血管分泌功能不全有關(guān)[4,5]。前期研究提出增齡（或老化，aging）是影響血管重構(gòu)的獨(dú)立因素[6,7]。然而，增齡影響血管重構(gòu)的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。目前的研究提示，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的表型調(diào)制和異常增殖是增齡性血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素[8-10]，且VSMC合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，包括膠原、彈力蛋白和蛋白聚糖。膠原和彈力蛋白的高表達(dá)導(dǎo)致血管硬化[11]。而膠原Ⅰ型和Ⅲ型合成和分泌的增加，在動(dòng)脈壁重建、動(dòng)脈瘤形成、動(dòng)脈粥樣硬化纖維帽的穩(wěn)定性方面有主要作用[12]。增齡與膠原和彈力蛋白的定量和定性變化相關(guān)[13]，可能的結(jié)構(gòu)性改變之一是膠原蛋白的重新定位[14]。本研究通過(guò)體外觀察VSMC前膠原α-多肽mRNA和前膠原的變化，旨在探討增齡對(duì)VSMC前膠原α-多肽基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。

山東省青島市科技發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2010KZJ-7）

作者單位：266071 山東省青島市，青島大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（魏美連）；青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院老年內(nèi)科（榮瑗瑗、康維強(qiáng)、宋達(dá)琳）；大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院（王瑩、宋達(dá)琳）

宋達(dá)琳，E-mail：dsong55cn@aliyun.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．09．021

Q95-33；R543

A

1672-5301（2015）09-0851-05

2015-04-28）