孫穎穎 王冀 嚴(yán)宇鵬 李莉 魏慶慶 胡羅文 李鷗

自發(fā)性高血壓大鼠心肌細胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑

孫穎穎 王冀 嚴(yán)宇鵬 李莉 魏慶慶 胡羅文 李鷗

作者單位：100028 北京市，煤炭總醫(yī)院ICU

目的 探討高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的凋亡途徑。方法 購買普通Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（8周齡）30只和自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs）（8周齡）30只。隨機各取10只大鼠處死后保留心臟標(biāo)本，余給予普通飼料分別喂養(yǎng)至16周、32周。應(yīng)用超聲心動圖等技術(shù)判定各組大鼠左室肥厚程度及左室舒張功能。大鼠符合實驗要求后全部處死，留取標(biāo)本。行TUNEL法檢測心肌細胞凋亡情況，分別用免疫組化法及免疫印跡檢測GRP78、caspase-12蛋白的表達水平。結(jié)果SHRs心肌組織GRP78、Caspase-12的表達升高。結(jié)論 高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中可能與ERS相關(guān)的Caspase-12通路介導(dǎo)心肌細胞凋亡相關(guān)。

高血壓； 凋亡； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

高血壓最終會導(dǎo)致心功能障礙，細胞凋亡是可能機制之一。研究已經(jīng)證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是介導(dǎo)細胞凋亡的重要通路。本研究在自發(fā)性高血壓大鼠動物模型基礎(chǔ)上，觀察ERS相關(guān)標(biāo)志性因子的表達情況，以探討其在高血壓心肌損害中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

1.1.1 實驗動物 購買普通Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（8周齡）30只和自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs）（8周齡）30只。隨機各取10只大鼠處死后保留心臟標(biāo)本，余給予普通飼料分別喂養(yǎng)至16周、32周。應(yīng)用超聲心動圖等技術(shù)判定各組大鼠左室肥厚程度及左室舒張功能。大鼠符合實驗要求后全部處死，留取標(biāo)本。

1.1.2 試劑及藥物

1.1.2.1 HE染色所需試劑 Harris蘇木素、鹽酸酒精、1%氨水返藍、伊紅染液、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯溶液、中性樹膠等，均由西苑醫(yī)院中心實驗室提供。

1.1.2.2 TUNEL染色所需試劑 TUNEL染色試劑盒購自南京凱基生物公司，產(chǎn)品編號KGA 703。

1.1.2.3 免疫組化、免疫印跡所需試劑 ①抗羊GRP78多克隆抗體（SC-1611）：美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。②抗大鼠Caspase-12單克隆抗體（SC-21747）：美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。③辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。④DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。⑤預(yù)染蛋白marker（相對分子質(zhì)量20～120 KD）：標(biāo)定相對分子質(zhì)量為 20 KD、26 KD、36 KD、47 KD、85 KD、118 KD，美國 Fermentas公司產(chǎn)品。⑥增強的化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL試劑盒）：Amersham Phamacia Biotech公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 收縮壓的測定及大鼠左室重量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）的比較 采用 RBP-1型大鼠無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)，測量大鼠安靜、清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓，連測3次，取平均值。用分析天平稱取左心室重量（LVM，包括室間隔），計算 LVMI。

LVMI=LVM（mg）/體重（BM，g）

1.2.2 超聲心動圖檢查 M型超聲測量室間隔（IVS）和左室后壁（LVPW）厚度，短軸縮短率（FS）及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；脈沖多普勒頻譜測定二尖瓣E波最大速度、A波最大速度、E/A比值；連續(xù)多普勒頻譜測定等容舒張時間（IVRT）。

1.2.3 HE染色 切片經(jīng)Harris蘇木素浸染6 min左右，水洗2 min，1%的鹽酸乙醇分化5 s，水洗，伊紅染2 min，流水快速沖洗、脫水、透明、封片固定，光鏡下觀察心肌細胞形態(tài)。

1.2.4 TUNEL法檢測凋亡細胞 切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟、復(fù)水后嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒要求檢測凋亡細胞。觀察5個高倍視野，計數(shù)每高倍鏡視野TUNEL“+”細胞核數(shù)目。

1.2.5 免疫組化法檢測GPR78、caspase-12蛋白表達 石蠟切片脫蠟、水化后置于0.3%H2O2處理10 min，然后進行微波修復(fù)10～15 min；室溫冷卻30～40 min；PBS 洗 3～5 min×3；5%牛血清白蛋白封閉，室溫孵育20 min；分別滴加GRP78多克隆抗體（1∶200稀釋）、Caspase-12多克隆抗體（1∶100稀釋）的一抗，同時作PBS對照，4℃過夜；沖洗后滴加1∶400的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min；水洗、顯色、蘇木素復(fù)染后乙醇脫水封片。

1.2.6 免疫印跡檢測GPR78、caspase-12蛋白表達 取左室組織，提取總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、ECL顯色等步驟，檢測GRP78、Caspase-12的蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 由SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包完成數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，兩組均數(shù)間比較采用小樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓監(jiān)測及心臟重量與體重的比值 最終全部大鼠完成了實驗。SHRs血壓呈持續(xù)升高趨勢。與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡、16周齡、32周齡組SHRs的血壓均顯著升高（P＜0.05）。與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡組SHRs的心臟重量與體重比值未見明顯變化，16周齡和32周齡組SHRs的心臟重量與體重比值均明顯增加（P＜0.05）。見圖 1。

2.2 超聲心動圖檢測 與WKY大鼠相比，SHRs的 IVS和 LVPW 均明顯增加（P＜0.05）；SHRs的E/A比值顯著增加（E/A＞2），提示SHRs大鼠的心臟舒張功能己明顯受損。見表1。

2.3 HE染色 HE染色顯示，對照組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞核大小均一，胞漿染色均勻；8周齡組SHRs與對照組比較未見顯著性變化，仍可見心肌細胞排列整齊，細胞核大小均一，胞漿染色均勻；16周齡組SHRs心肌細胞肥大，細胞核出現(xiàn)增大、畸形等改變，肌纖維排列較紊亂；32周齡組SHRs可出現(xiàn)心肌細胞的變性，呈局灶性、片狀壞死，心肌纖維粗大、斷裂等，微血管管壁增厚，管腔狹小，管周纖維組織增多。

2.4 TUNEL染色 與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡組SHRs的心肌細胞凋亡無明顯增加；16周齡組SHRs的心肌細胞凋亡明顯增加（P＜0.05）；32周齡組SHRs的心肌細胞凋亡顯著增加（P＜0.01）。與8周齡組的SHRs相比，16、32周齡組SHRs心肌細胞凋亡均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 2。

2.5 免疫組織化學(xué)檢測

2.5.1 GRP78 對照組大鼠心肌組織內(nèi)可見少量、分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒，主要定位于心肌細胞胞漿內(nèi)。8周齡、16周齡、32周齡組SHRs與同周齡對照組大鼠相比較，胞漿內(nèi)可見明顯增多的濃密深棕色顆粒（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。見圖 3。

2.5.2 Caspase-12 8周齡組SHRs及對照組大鼠心肌組織內(nèi)可見少量、分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒，主要定位于心肌胞漿內(nèi)。與同周齡的WKY大鼠相比，16周齡、32周齡組SHRs的心肌細胞胞漿內(nèi)可見明顯增多的濃密深棕色顆粒（P＜0.01）。見圖4。

2.6 免疫印跡檢測

2.6.1 GRP78 與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡組SHRs心肌組織的GRP78蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；16周齡組和32周齡組SHRs心肌組織的GRP78蛋白表達顯著增加（P＜0.01），見圖5。

2.6.2 Caspase-12 與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡組SHRs心肌蛋白的Caspase-12蛋白表達無明顯增加；16周齡組、32周齡組SHRs的心肌組織的Caspase-12蛋白表達顯著增加（P＜0.01），見圖 5。

3 討論

高血壓時大量心肌細胞的凋亡可使心肌細胞減少、室壁變薄，導(dǎo)致左心室?guī)缀涡螤罡淖儾殡S著Ⅰ型膠原的生成及局部間質(zhì)組織的增生，成為導(dǎo)致心功能障礙的重要因素之一[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓組大鼠的心肌細胞中，可見明顯增加的凋亡細胞，同時GRP78表達水平升高，而GRP78表達的上調(diào)是目前公認(rèn)的ERS激活的標(biāo)志[2,3]，提示ERS介導(dǎo)了高血壓所致的心肌細胞凋亡。ERS引起的細胞凋亡不同于線粒體細胞凋亡，它有一套自身的信號傳遞通路，即ERAD途徑。ERAD途徑包含ERS誘導(dǎo) CHOP/GADD153 表達[4]、JNK 的活化[5]和 Caspase-12蛋白水解酶的活化[6]。Caspase-12定位于ER外膜，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵分子，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化[7]。研究表明，Caspase-12與ERS介導(dǎo)凋亡的機制有關(guān)，而與非ERS介導(dǎo)的凋亡無關(guān)。Caspase-12與其他的Caspases一樣以無活性的酶原形式存在。ERS引起Caspase-12激活，激活的Caspase-12與另外的ERS分子協(xié)同使Caspase-9激活，活化Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效應(yīng)Caspase，效應(yīng)Caspase切割多ADP聚合酶和多種其他細胞內(nèi)的底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。Caspase-12對Caspase-9的激活不依賴線粒體凋亡途徑成分Apaf-1和Cyt C。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，8周齡的SHRs與同周齡的WKY大鼠相比，未見明顯增多的凋亡細胞。我們推測，在高血壓的初期階段，血壓增高及其他因素的影響只是引起了UPR。UPR的啟動在早期是發(fā)揮一種保護作用，使大部分蛋白質(zhì)合成停滯，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷。通過加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶基因、蛋白水平的高表達，如 GRP78/Bip，Calnexin，GRP94 等，以協(xié)助蛋白質(zhì)折疊，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解，清除不能正確折疊的蛋白質(zhì)。這種保護性機制很快阻止了新生蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的轉(zhuǎn)運，抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負荷過重，從而積極重建細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。但當(dāng)應(yīng)激原強度超過細胞自身處理能力時，保護機制不能與損傷抗衡，ERS則以凋亡的方式引發(fā)細胞死亡。因此，在16周齡和32周齡的SHRs的心肌細胞中，可見明顯增加的凋亡細胞，同時Caspase-12凋亡通路被激活。我們推測高血壓狀態(tài)下可能存在以下誘導(dǎo)ERS的因素：①血壓的升高。動脈血壓長期增高是平滑肌及心肌細胞凋亡的有效刺激[8]，且高血壓動物主動脈平滑肌細胞對于轉(zhuǎn)化生長因子2β、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等凋亡刺激的反應(yīng)性明顯增加[9]。②鈣離子失衡。細胞內(nèi)Ca2+主要貯存于SR，其水平受SR鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白如SR鈣泵（SERCA）等調(diào)控。釋放于肌漿內(nèi)的Ca2+在SERCA的調(diào)控下逆濃度差而進入SR。因此，當(dāng)SERCA活性發(fā)生異常改變時，必然引致細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，從而促進或抑制細胞增殖與細胞凋亡的過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓左心室肥厚過程中，SERCA活性顯著降低，與心肌細胞凋亡指數(shù)（cardiac myocyte apoptosis index，CMAI） 和 LVMI 呈顯著負相關(guān)。這可能是由于細胞漿內(nèi)游離Ca2+向SR內(nèi)泵入減少，造成胞內(nèi)［Ca2+］i過度升高，直接誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，最終導(dǎo)致左心室肥厚的發(fā)生[9]。③AngⅡ。AngⅡ能激活心肌細胞核內(nèi)Ca2+依賴的DNA酶活性，導(dǎo)致DNA裂解、細胞凋亡[10]。與WKY大鼠相比，AngⅡ在SHRs中更容易誘發(fā)心肌細胞的凋亡，而且凋亡程度與Bax的表達和Caspase-3的活性相關(guān)。因此，AngⅡ水平的升高極可能會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)調(diào)控細胞凋亡的靶點活化從而激活ERS。

表1 實驗期間各組大鼠常規(guī)超聲心動圖指標(biāo)比較（±s）

表1 實驗期間各組大鼠常規(guī)超聲心動圖指標(biāo)比較（±s）

注：與WKY大鼠比較，aP＜0.05

組別 室間隔厚度（mm） 左室后壁厚度（mm） E/A 8周 16周 32周 8周 16周 32周 8周 16周 32周WKY 大鼠 2.10±0.04 2.25±0.05 2.34±0.49 1.70±0.07 1.80±0.07 2.00±0.09 1.57±0.11 1.65±0.09 1.42±0.68 SHRs 1.97±0.06 2.64±0.91a 2.78±0.08a 2.40±0.16a 2.40±0.24a 2.62±0.11a 1.49±0.06 1.38±0.04 2.46±0.20a組別等容舒張時間（ms） 短軸縮短率（%） 射血分?jǐn)?shù)（%）8周 16周 32周 8周 16周 32周 8周 16周 32周WKY 大鼠 24.95±0.53 26.45±0.90 28.42±0.70 47.39±0.84 48.77±0.50 49.03±0.70 71.44±0.76 72.43±1.00 72.87±1.10 SHRs 25.26±0.60 31.79±0.94a 29.94±0.69 47.18±0.70 48.12±0.89 48.85±0.84 71.58±0.80 72.59±0.79 71.77±1.02

總之，三條ERS相關(guān)凋亡通路在細胞凋亡發(fā)生過程中并非同時激活，每條通路激活與ERS的誘發(fā)因素、細胞類型和細胞狀態(tài)等都有關(guān)系。在本研究中，我們選取了GRP78、Caspase-12作為ERS的標(biāo)志性因子，其中GRP78表達增高已被廣泛認(rèn)為是UPR啟動的標(biāo)志，而 Caspase-12則是ERS促凋亡途徑的特有產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，SHRs大鼠心臟內(nèi)ERS的標(biāo)志性因子GRP78、Caspase-12蛋白水平表達均明顯升高。結(jié)合ERS在其他細胞中的促凋亡作用，提示ERS導(dǎo)致了SHRs大鼠的心肌細胞凋亡，從而在高血壓所致的左室肥厚到左室舒張功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

圖1 實驗期間各組大鼠血壓、LVMI比較

圖2 實驗期間各組大鼠心肌組織TUNEL法檢測凋亡細胞

圖3 實驗期間各組大鼠心肌組織免疫組化法檢測GPR78蛋白表達

圖4 實驗期間各組大鼠心肌組織免疫組化法檢測caspase-12蛋白表達

圖5 實驗期間各組大鼠心肌組織免疫印跡法檢測GPR78、Caspase-12蛋白表達

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Endoplasmic reticulum stress pathway involved in myocardial apoptosis in spontaneously hypertensive rats

SUN Ying-ying，WANG Ji，YAN Yü-peng，et al.Department of ICU，China MeiTan General Hospital，Beijing 100028，China

Objective Endoplasmic reticulum（ER）stress is one of the intrinsic apoptosis pathways and apoptosis occurs in the critical organ in hypertension.However，the mechanisms by which ER stress lead to apoptosis remain enigmatic，particularly in the progression from cardiac hypertrophy to diastolic heart failure resulting from hypertension.Methods We used spontaneously hypertensive rats（SHRs） to investigate possible signaling pathways for ER stress.Results We found that the protein level of glucose regulated protein 78 were upregulated，and the caspase-12 dependent pathways was activated.Conclusion These results suggest that ER stress can con－tribute to myocardial apoptosis during this progression.

Hypertension； Apoptosis； Endoplasmic reticulum stress

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．09．022

Q95-33；R544.1

A

1672-5301（2015）09-0855-04

2015-04-22）