王銳，郭麗，李永春，崔華峰，管琳

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250011）

·動(dòng)物實(shí)驗(yàn)·

調(diào)心安神針法調(diào)節(jié)室性心律失常模型兔心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的免疫組化研究

王銳1，郭麗1，李永春2，崔華峰1，管琳1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250011）

目的 研究調(diào)心安神針法對(duì)于室性心律失常模型兔心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白 43（connexin43，Cx43）的影響。方法采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型。40只新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、針刺組、藥物組，針刺組施以調(diào)心安神針刺法（取靈臺(tái)、神道及雙側(cè)內(nèi)關(guān)、百會(huì)），藥物組給予鹽酸普羅帕酮片（心律平）灌胃。實(shí)驗(yàn)完畢后取兔左心室，通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)及計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)對(duì)Cx43的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 模型組Cx43的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），針刺組及藥物組Cx43的表達(dá)均較模型組增加（P＜0.05），二者之間無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)可能是該針法治療心律失常的靶點(diǎn)之一。

針刺；調(diào)心安神針法；心律失常，室性；縫隙連接蛋白43；免疫組織化學(xué)法

室性心律失常是臨床常見的心臟疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚者危及生命。有研究發(fā)現(xiàn)，室性心律失常是年齡超過 35歲成人的幾個(gè)心源性猝死的危險(xiǎn)因素之一［1-3］。近年來的研究表明，縫隙連接蛋白43（Cx43）在室性心律失常發(fā)生中具有重要作用［4-6］。筆者基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)，由靈臺(tái)、神道、內(nèi)關(guān)、百會(huì)穴組成調(diào)心安神方，并施行特定的手法操作，治療早搏取得了滿意的療效［7］。我們采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型，觀察調(diào)心安神針法對(duì)其心肌細(xì)胞Cx43的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

新西蘭兔40只，體重1.5～2.0 kg，雌雄各半，由山東省農(nóng)科院提供，合格證號(hào)為 SCXK（魯）20090013。一抗為兔抗 Cx43，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為990387W。二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為 101964。DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為12171A08。

1.2 分組與建模

40只新西蘭兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即對(duì)照組、模型組、針刺組、藥物組，每組10只。用10%水合氯醛按 5 mL/kg腹腔注射麻醉（藥物組給藥 1 h后），仰位固定于固定臺(tái)上。將針形電極插入四肢遠(yuǎn)端皮下，選擇標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，待心電圖穩(wěn)定后沿耳緣靜脈注射20%氯化鋇10 mL/kg造成室性心律失常模型。藥物組予鹽酸普羅帕酮40 mg/kg灌胃，其余各組不予處理。

1.3 針刺方法

參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)《動(dòng)物針灸穴位圖譜》，針刺組于造模后即刻給予針刺內(nèi)關(guān)、百會(huì)、靈臺(tái)、神道。靈臺(tái)、神道穴位于背部胸椎6-7及5-6棘突間，向上斜刺5 mm，用震顫法快速小幅度行針1 min后起針；百會(huì)穴位于第7腰椎與第1薦椎棘突間，向后平刺5 mm；內(nèi)關(guān)穴位于前臂下1/6折點(diǎn)處內(nèi)側(cè)，橈、尺骨間隙中，雙側(cè)內(nèi)關(guān)分別直刺5 mm，行針1 min后接電針治療儀，選疏密波，刺激強(qiáng)度以家兔上肢出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為度。各組均觀察體表心電變化，留針至恢復(fù)正常心律后停止記錄，拔出針形電極，立即處死動(dòng)物，取左心室。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心電圖時(shí)相性觀察

采用十二導(dǎo)電生理記錄儀記錄心電變化，以心律失常消失300 s以上為恢復(fù)正常心律。

1.4.2 心肌細(xì)胞Cx43免疫組化檢測(cè)

將心臟組織置于40 g/L中性甲醛液中固定，經(jīng)石蠟包埋后，連續(xù)切片3張，切片厚4 μm，其中1張用于HE染色以觀察組織的大致形態(tài)，另2張用于免疫組織化學(xué)染色。采用SP法，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。在OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下10×40倍放大拍照，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，Leica Qwin3軟件分析系統(tǒng)分析陽性表達(dá)面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 室性心律失常持續(xù)時(shí)間比較

結(jié)果表明，模型組、針刺組及藥物組造模后均出現(xiàn)室性心律失常，以室性早搏為主，其次為室速。模型組心律失常持續(xù)時(shí)間為（36.4±21.5）min，針刺組心律失常持續(xù)時(shí)間為（17.1±9.8）min，藥物組心律失常持續(xù)時(shí)間為（12.6±6.2）min，3組持續(xù)時(shí)間比較，模型組最長(zhǎng)，針刺組次之，藥物組最短。針刺組、藥物組與模型組比較均有顯著差異（P＜0.05），針刺組與藥物組之間無差異（P＞0.05）。

2.2 各組心肌組織HE染色

對(duì)照組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，無異常形態(tài)學(xué)改變。模型組心肌組織中可見部分心肌纖維腫脹，核明顯變大，少數(shù)心肌細(xì)胞胞漿嗜伊紅染色增強(qiáng)，心肌細(xì)胞之間可見連接疏松，心肌間質(zhì)血管外膜增厚、水腫，累及部分中膜，增厚的血管周圍心肌纖維腫脹，胞漿疏松，血管周圍組織疏松。針刺組與藥物組少數(shù)心肌細(xì)胞腫脹、細(xì)胞間輕度疏松溶解，心肌間質(zhì)組織中血管管壁輕度增厚，偶見小灶狀心肌纖維變性；小血管輕度增厚，外膜輕度水腫。詳見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色（×400）

2.3 各組心肌組織免疫組化染色

2.3.1 染色比較

對(duì)照組心肌細(xì)胞中可見較多的棕黃色 CX43蛋白表達(dá)，模型組則較少表達(dá)或消失，針刺組與藥物組中可見部分棕黃色CX43表達(dá)。詳見圖2。

圖2 各組心肌組織免疫組化染色（×400）

2.3.2 Cx43陽性表達(dá)面積比較

模型組、針刺組、藥物組Cx43陽性表達(dá)面積檢測(cè)灰度值分別為（127.9±16.7）、（177.7±19.4）、（186.5±13.3），對(duì)照組為（206.7±11.3），結(jié)果表明，模型組、針刺組、藥物組Cx43陽性表達(dá)面積均較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），對(duì)照組與藥物組較模型組明顯增加（P＜0.01），針刺組與藥物組之間無差異（P＞0.05）。

3 討論

靜脈注射氯化鋇是造成室性心律失常模型的常用方法之一［8］。氯化鋇可增加浦氏纖維Na+內(nèi)向電流，提高舒張期去極化的速率，從而誘發(fā)異位性節(jié)律。我們給予兔耳緣靜脈注射氯化鋇的劑量為10 mg/kg，發(fā)現(xiàn)誘發(fā)兔的心律失常主要為室性早搏和室性心動(dòng)過速。

細(xì)胞縫隙連接通道是相鄰細(xì)胞電學(xué)和化學(xué)代謝耦聯(lián)的基礎(chǔ)，Cx43是其構(gòu)成的主要電耦聯(lián)蛋白。心肌細(xì)胞Cx43的重構(gòu)會(huì)致心肌細(xì)胞間電活動(dòng)的同步性、協(xié)調(diào)性改變，電傳導(dǎo)速度及各向異性的改變等，從而誘發(fā)心律失常。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Cx43表達(dá)下降的程度對(duì)誘導(dǎo)室性心律失常的發(fā)生具有重要的影響［2］，心肌缺血病灶及其鄰近區(qū)域Cx43的數(shù)量及分布的高度不均一性是折返性心律失常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［9］。近年合成的抗心律失常多肽即通過上調(diào)Cx43的磷酸化水平而發(fā)揮抗心律失常作用［10］。鹽酸普羅帕酮片（心律平）作為臨床上最常用的抗心律失常藥物，能降低蒲肯野氏纖維、心室肌和心房肌的自律性，減慢其傳導(dǎo)速度，有輕度β-受體阻斷作用和輕微的鈣通道阻滯作用［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸普羅帕酮片平能降低模型兔室性心律失常持續(xù)時(shí)間，并能增加心肌細(xì)胞中Cx43的表達(dá)。對(duì)于后者，我們推測(cè)，這可能是鹽酸普羅帕酮片通過抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+，從而影響Cx43的磷酸化過程，最終影響Cx43的表達(dá)。

內(nèi)關(guān)穴對(duì)心臟有相對(duì)特異性。以往的研究發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)穴可改善左心功能，增強(qiáng)心肌缺血時(shí)的收縮力［12］，增加心肌組織灌流量，改善末梢循環(huán)，糾正由于心肌缺血而誘發(fā)的心律失常［13］，減少了后除極電位和心律不齊的發(fā)生率［14］。靈臺(tái)、神道穴對(duì)于早搏也具有相對(duì)特異性的治療作用［15］，在調(diào)心安神針法中要求兩穴的操作須力求使針感向前胸或側(cè)胸部放散，即“氣至病所”。有學(xué)者認(rèn)為，Cx43可能是構(gòu)成穴位的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，針刺后穴位處Cx43表達(dá)增加激活了間隙連接通道，促進(jìn)了Ca2+、cAMP、IP3或其他小分子物質(zhì)快速傳遞至相應(yīng)臟器，形成了“氣至病所”的物質(zhì)基礎(chǔ)［16］，進(jìn)而調(diào)節(jié)臟器功能。

本實(shí)驗(yàn)表明，造模后給予調(diào)心安神針法，可以減少心肌細(xì)胞的損傷，明顯縮短室性心律失常持續(xù)時(shí)間，增加左心室心肌細(xì)胞中Cx43的表達(dá)。眾所周知，針刺治療心律失常是個(gè)多靶點(diǎn)、多層次、多途徑的過程。雖然調(diào)心安神針法增加心肌細(xì)胞中Cx43表達(dá)的過程和機(jī)制尚不清楚，但我們認(rèn)為，這可能是該針法治療室性心律失常的機(jī)理之一。

［1］ Germano JJ, Reynolds M, Essebag V, et al. Frequency and causes of implantable cardioverter-defibrillator therapies: is device therapy proarrhythm ic?[J]. Am J Cardiol, 2006，97（8）：1255-1261.

［2］ 翁菲菲.胺碘酮治療冠心病室性心律失常療效分析［J］.中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2015，6（12）：65-66.

［3］ 吳翔.胺碘酮治療慢性心力衰竭合并室性心律失常的臨床應(yīng)用［J］.臨床合理用藥雜志，2015，8（2）：76-77.

［4］ Danik SB, Liu F, Zhang J, et al. Modulation of cardiac gap junction expression and arrhythmic susceptibility[J]. Circ Res, 2004，95（10）：1035-1041.

［5］ Peters NS. Drugs for ventricular arrhythmias in the era of the implanttable cardioverter defibrillator[J]. Eur Heart J, 1999，20（5）：321-323.

［6］ Rakotovao A, Tanguy S, Toufektsian MC, et al. Selenium status as determinant of connexin-43 dephosphorylation in ex vivo ischemic/ reperfused rat myocardium[J]. J Trace Elem Med Biol, 2005，19（1）：43-47.

［7］ 王銳，張寧寧，譚奇紋，等.針刺調(diào)心安神法治療心臟過早搏動(dòng)的臨床研究［J］.世界針灸雜志，2012，22（2）：34-37.

［8］ 李儀奎，王欽茂.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991：381.

［9］ 楊寶峰.藥理學(xué)［M］.第 6版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：210-211.

［10］ Weng S, Lauven M, Schaefer T, et al. Pharmacological modification of gap junction coupling by an antiarrhythm ic peptide via protein kinase C activation[J]. FASEB J, 2002，16（9）：1114-1116.

［11］ 張家銓，吳景時(shí)，程鵬.常用藥物手冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：388.

［12］ 曹建萍.近 10年針灸治療冠心病臨床研究概況［J］.中國(guó)針灸，2001，21（1）：57-60.

［13］ 張馨蘭，張福云，韓鳳娟.穴位注射治療室性心律失常30例［J］.中國(guó)針灸，1996，16（6）：12.

［14］ 黃娥梅，吳緒平，王亞文，等.電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)家兔急性心肌缺血在體心室肌細(xì)胞跨膜電位的影響［J］.針刺研究，1995，20（2）：33-35.

［15］ 王銳，張寧寧，譚奇紋，等.電針靈臺(tái)、神道穴對(duì)心臟過早搏動(dòng)的影響［J］.中國(guó)針灸，2013，33（5）：385-387.

［16］ 李得浩，景向紅，楊麗娟，等.針刺對(duì)大鼠不同部位穴位 Cx43表達(dá)的影響［J］.中國(guó)針灸，2012，32（5）：431-434.

Immunohistochem ical Study of Heart-regulating and M ind-calm ing Acupuncture for Ad justing Cx43 Expression in M yocardial Cells in a Rabbit M odel of Ventricular Arrhythmia

WANG Rui1, GUO Li1, LI Yong-chun2, CUI Hua-feng1, GUAN Lin1.
1.S handong University of Traditional Chinese Medicine Hospital,Jinan 250011,China; 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250011,China

Objective To investigate the effect of heart-regulating and mind-calming acupuncture on the expression of gap junction protein connexin43 (Cx43) in myocardial cells in a rabbit model of ventricular arrhythmia. Method A rabbit model of ventricular arrhythmia was made by injecting barium chloride into the marginal ear vein. Forty New Zealand rabbits were randomized into control, model, acupuncture and medication groups. The acupuncture group received heart-regulating and m ind-calming acupuncture [at Lingtai (GV10), Shendao (GV 11), bilateral Neiguan (PC6) and Baihui (GV20)] and the medication group, oral gavage of propafenone. Rabbit left ventricle was taken after the completion of the experiment. Cx43 expressions were compared and analyzed using an immunohistochem ical staining technique and a computer image processing system. Result Cx43 expression decreased significantly in the model group compared w ith the control group (P＜0.01) and increased in the acupuncture and medication groups compared w ith the model group (P＜0.05). There was no significant difference in Cx43 expression between the acupuncture and medication groups (P＞0.05). Conclusion Adjusting Cx43 expression in myocardial cells may be one of the target points for this acupuncture treatment of arrhythm ia

Acupuncture; Heart-regulating and mind-calming acupuncture; Arrhythmia, ventricular; Gap junction protein connexin43; Immunohistochemical method

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.12.1241

1005-0957（2015）12-1241-03

2015-04-20

國(guó)家中醫(yī)藥管理局針灸重點(diǎn)學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng)目；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013ZDZK-014）

王銳（1965 - ），男，主任醫(yī)師，Email：wr_6510@163.com