王 濤，王 峰，何 煒，單爭(zhēng)爭(zhēng)，樊青霞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052

食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率和病死率均位居第1 位，發(fā)病世標(biāo)率位于第6 位，死亡世標(biāo)率位于第12 位［1］。早期食管癌癥狀輕微，當(dāng)出現(xiàn)臨床表現(xiàn)而就醫(yī)時(shí)，大部分已處于中晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而化療則成為治療中晚期食管癌的重要手段之一;但目前所用的化療藥物不良反應(yīng)較大，患者耐受性差，且容易產(chǎn)生抗藥性［2-3］。研究［4-6］顯示，二甲雙胍能抑制結(jié)腸癌、乳癌、肝癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Kobayashi 等［7］的研究顯示，二甲雙胍可以抑制TT、KYSE30 及KYSE70 3種食管癌細(xì)胞系細(xì)胞的增殖。有研究報(bào)道:mTOR 通路下游靶蛋白4EBP1 和S6K1在腫瘤的細(xì)胞周期、增殖、血管生成及凋亡調(diào)控中發(fā)揮巨大的作用［8］，4EBP1 高表達(dá)是子宮內(nèi)膜癌的不良預(yù)后因素［9］，S6K1 低表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞有抑制作用［10］。作者用不同濃度二甲雙胍作用于食管癌KYSE450 細(xì)胞系，觀察其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 人食管癌KYSE450 細(xì)胞系為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院贈(zèng)送，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，二甲雙胍購(gòu)自Sigma 公司，MTT 和Annexin VFITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，4EBP1 和S6K1 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)和合成，鼠抗人4EBP1和S6K1 單克隆抗體購(gòu)自CST 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Abcam 有限公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) KYSE450 細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中。

1．3 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE450 細(xì)胞，胰蛋白酶消化處理后按5 000個(gè)/孔接種于96 孔板中培養(yǎng)過夜，24 h 后分為空白對(duì)照組和不同濃度二甲雙胍用藥組(終濃度分別為5、10、20 和40 mmol/L 的二甲雙胍)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h后，各孔分別加入5 g/L 的MTT 20 μL，37℃孵育4 h 后棄上清，加入DMSO 150 μL，室溫振蕩搖勻，于酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(A空白對(duì)照組－A實(shí)驗(yàn)組)/A實(shí)驗(yàn)組×100%。

1．4 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE450 細(xì)胞，胰蛋白酶消化處理后，1．5 ×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，貼壁后無血清培養(yǎng)24 h，用含不同濃度［0(對(duì)照)、5、10 和20 mmol/L］二甲雙胍的培養(yǎng)液作用48 h 后，按Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1．5 KYSE450 細(xì)胞中4EBP1 和S6K1 mRNA 表達(dá)的RT-PCR 檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE450 細(xì)胞，按3 ×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，貼壁后無血清培養(yǎng)24 h。①用含不同濃度［0(對(duì)照)、5、10 和20 mmol/L］二甲雙胍的培養(yǎng)液作用48 h 后，收集細(xì)胞。②用含20 mmol/L 二甲雙胍的培養(yǎng)液培養(yǎng)0(對(duì)照)、24、48 或72 h 后，收集細(xì)胞。Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度法檢測(cè)總RNA 的純度及濃度。按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 模板1 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，用無RNA 酶水補(bǔ)足反應(yīng)體系50 μL。4EBP1 上游引物序列5'-AAGCACCAGCCATCGTGT-3'，下游引物序列5'-CTTTCCCAAGCACATCAACC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為371 bp;S6K1 上游引物序列5'-ATTTGCCTCCCTAC CTCACAC-3'，下游引物序列5'-AACCCAGAAAGAC CTGATTGG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為300 bp;GAPDH 上游引物序列5'-TGATTCCACCCATGGCAAATTCC-3'，下游引物序列5'-ACAGCCTTGGCAGCGCCAGTAGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為504 bp。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56/54℃(4EBP1/S6K1)退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。取5 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果取目的基因條帶和GAPDH 條帶灰度值的比值。實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1．6 KYSE450 細(xì)胞中4EBP1 和S6K1 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1．5。按照蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行BCA 蛋白定量及SDS-PAGE 凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，加一抗(按1∶1 000 稀釋)室溫下孵育2 h 后，TBST 洗膜，加入二抗(按1∶2 000 稀釋)，孵育后ECL 顯色。用Quantity One 定量分析軟件分析結(jié)果，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行分析，應(yīng)用4 ×3 析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同濃度二甲雙胍培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)KYSE450 細(xì)胞的增殖抑制率，應(yīng)用單因素方差分析比較不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞中4EBP1、S6K1 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響以及20 mmol/L 二甲雙胍作用不同時(shí)間對(duì)KYSE450 細(xì)胞中4EBP1、S6K1 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞增殖的抑制作用 見表1。MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度二甲雙胍對(duì)食管癌KYSE450 細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。

表1 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞的增殖抑制率(n=5) %

2．2 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞凋亡的影響 5、10 和20 mmol/L 的二甲雙胍作用于KYSE450 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞凋亡率分別為(20．8 ±1．4)%、(30．1 ±1．6)%和(39．7 ±1．4)%，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(5．8 ±1．9)% 。結(jié)果表明，隨著二甲雙胍濃度的增加，KYSE450 細(xì)胞的凋亡率也逐漸上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=282．076，P＜0．001)。

2．3 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響 見圖1、2 和表2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度二甲雙胍作用后4EBP1、S6K1 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平明顯下降，并且與二甲雙胍的藥物濃度相關(guān)。

圖1 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 mRNA 表達(dá)的影響

圖2 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 蛋白表達(dá)的影響

表2 不同濃度二甲雙胍對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2．4 20 mmol/L 二甲雙胍處理不同時(shí)間對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響 見圖3、4 和表3。結(jié)果顯示，20 mmol/L 的二甲雙胍培養(yǎng)KYSE450 細(xì)胞24、48 或72 h 后4EBP1、S6K1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平逐漸下降，且呈時(shí)間依賴性。

圖3 20 mmol/L 二甲雙胍處理不同時(shí)間對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 mRNA 表達(dá)的影響

圖4 20 mmol/L 二甲雙胍處理不同時(shí)間對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 蛋白表達(dá)的影響

表3 20 mmol/L 二甲雙胍處理不同時(shí)間對(duì)KYSE450 細(xì)胞4EBP1、S6K1 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前二甲雙胍在臨床上仍是廣泛使用的治療糖尿病的基礎(chǔ)藥物。在多個(gè)回顧性研究［11-13］中發(fā)現(xiàn)，服用二甲雙胍的糖尿病患者其腫瘤患病率和病死率都較未服用二甲雙胍的糖尿病患者低。越來越多的實(shí)驗(yàn)證明二甲雙胍不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期有抑制作用［14］，并且可以抑制腫瘤細(xì)胞的代謝，且對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體復(fù)合物也有抑制作用［15］。mTOR 信號(hào)通路在惡性腫瘤的進(jìn)展過程中存在著過度激活現(xiàn)象［16］，4EBP1 和S6K1 是mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)通路中的2個(gè)重要下游底物［17］。研 究［18］證 實(shí)mTOR 是AMPK 主要的下游靶點(diǎn)之一，而二甲雙胍正是AMPK 的激活劑。

真核翻譯起始因子(eIF4E)結(jié)合蛋白(4EBP)屬于eIF4E 依賴性翻譯的負(fù)調(diào)控因子家族，eIF4E與5'帽結(jié)構(gòu)及其他2個(gè)蛋白(解旋酶eIF4A 和折疊蛋白eIF4G)結(jié)合成一個(gè)復(fù)合物——eIF4F［19-20］，促進(jìn)帽依賴蛋白翻譯起始，誘導(dǎo)增加了具有5'端非翻譯終端區(qū)域調(diào)控元件的下游靶基因mRNA 的翻譯，這些基因都是細(xì)胞從G1進(jìn)入S 期所必需的［21］。研究［22-24］發(fā)現(xiàn)4EBP1 在結(jié)腸癌、卵巢癌、乳癌和前列腺癌中高表達(dá)，且4EBP1 蛋白高表達(dá)與乳癌和前列腺癌的不良預(yù)后有關(guān)。該研究結(jié)果顯示，隨著二甲雙胍濃度的加大，食管癌KYSE450 細(xì)胞的增殖抑制率增加，凋亡率增加，可能與通過mTOR 信號(hào)通路使4EBP1 mRNA 和蛋白水平表達(dá)下降有關(guān)。

S6K1 也是mTOR 通路下游的重要底物之一，S6K1 是核糖體40S 小亞基S6 蛋白激酶，mTOR 可以使真核生物核糖體40S 亞單位上的S6 蛋白磷酸化而活化，從而增強(qiáng)含有5-TOP mRNA 的翻譯，此種mRNA 的翻譯產(chǎn)物包括胰島素生長(zhǎng)因子-2、核糖體蛋白、延伸因子等［25］;不僅如此，這些產(chǎn)物蛋白還包括HIF-1α，并參與調(diào)節(jié)Rb 蛋白、cyclinD1、cdk1/2、cdk 抑制劑(如p21Cip1 和p27Kip1)、RNA 聚合酶等［26］，這些蛋白都是細(xì)胞從G1過渡至S 期需要的［27］。有研究［28］發(fā)現(xiàn)，激活LKB1/AMPK/mTOR通路，下調(diào)mTOR/S6K1 活性，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。該研究結(jié)果顯示，二甲雙胍作用后KYSE450 細(xì)胞S6K1 mRNA 和蛋白的表達(dá)明顯降低，同時(shí)細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡率增加。

綜上所述，二甲雙胍作為一種不良反應(yīng)輕微、耐受性良好的藥物，其抗腫瘤作用的途徑是多方面的，作用通路是多樣的，這為研究新的腫瘤治療策略以及臨床應(yīng)用提供了更多的思路。

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