張斌 毛亮亮

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司 浙江臺(tái)州 318000）

微生物發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸及其樹脂分離性能的探討

張斌 毛亮亮

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司 浙江臺(tái)州 318000）

莽草酸是一種具有較高藥用價(jià)值的化合物，在醫(yī)藥、食品、工業(yè)等領(lǐng)域具有重要作用。莽草酸的生產(chǎn)方法很多，包括植物提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法等，從植物中提取時(shí)使用中草藥植物八角茴香，化學(xué)合成時(shí)以環(huán)戊二烯和苯醌為原料，微生物發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等微生物為工程菌。本文就莽草酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法做簡(jiǎn)單介紹，闡述了莽草酸樹脂分離性能等的研究，并對(duì)莽草酸未來(lái)發(fā)展應(yīng)用做出展望。

莽草酸 制備 微生物發(fā)酵 樹脂分離

莽草酸（Shikimic Acid）又名毒八角酸，分子式為C7H10O5，白色晶體粉末。莽草酸及其衍生物在炎癥、腫瘤、心血管、禽流感等疾病治療中發(fā)揮重要的作用［1］，從上世紀(jì)80年代開始，人們已經(jīng)開始對(duì)莽草酸及其衍生物的作用機(jī)理進(jìn)行研究。隨著人們迫切地想研究出治療這些疾病的方法，莽草酸的需求量越來(lái)越大。早期，莽草酸從八角茴香等植物中提?。?］，但隨著莽草酸的需求量不斷增大，植物提取遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足莽草酸的需求量，再加上植物種植的時(shí)間、地域限制和提取方法的繁瑣復(fù)雜，人們將希望寄托在其它提取方法上?；铣煞ㄌ崛∶Р菟岬漠a(chǎn)率和純度相對(duì)植物提取法有著明顯的提高，但化學(xué)合成法的原始材料來(lái)源有限，并且生成的化學(xué)廢棄物容易污染環(huán)境，這也使得該法沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法使用生物技術(shù)手段，改造生成能夠大量生產(chǎn)莽草酸的工程菌，利用微生物發(fā)酵培養(yǎng)大量積累莽草酸，由于微生物生長(zhǎng)周期短、效率高、成本低、適合大量生產(chǎn)，使得該法廣泛應(yīng)用到社會(huì)生產(chǎn)中。

1 莽草酸的制備

莽草酸的制備方法有很多，植物提取法從八角茴香中利用傳統(tǒng)工藝提取出莽草酸；化學(xué)合成法以環(huán)戊二烯和苯醌為原料合成莽草酸；微生物合成法利用生物技術(shù)手段改造工程菌株的代謝途徑，使其大量積累莽草酸。常用的工程菌株有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等［3］。

1.1 大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸

利用基因工程手段調(diào)整大腸桿菌工程菌的代謝途徑，切斷莽草酸生成后進(jìn)一步代謝的途徑，從而使莽草酸大量積累。其原理是大腸桿菌基因中aroK和aroL兩個(gè)基因分別編碼莽草酸激酶Ⅰ和莽草酸激酶Ⅱ［4］，這兩個(gè)激酶負(fù)責(zé)莽草酸的進(jìn)一步代謝，其中莽草酸激酶Ⅱ比莽草酸激酶Ⅰ的Km值小，因此使用基因工程方法敲除大腸桿菌工程菌中的aroL基因，有助于莽草酸的積累［5］。如果將大腸桿菌工程菌中aroK和aroL兩個(gè)基因全部敲除，將更有利于莽草酸的積累。

1.2 其它微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸

除了大腸桿菌應(yīng)用于莽草酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)外，枯草芽孢桿菌等也可用于發(fā)酵生產(chǎn)。其它工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸方法同大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)方法類似，也是敲除莽草酸激酶編碼基因，從而達(dá)到積累莽草酸的目的。但在2002年，又出現(xiàn)了新的工程菌構(gòu)建方法，即誘導(dǎo)并篩選EPSP合成缺陷菌株，從而積累莽草酸和3’-磷酸莽草酸，再加熱時(shí)3’-磷酸莽草酸又可以轉(zhuǎn)變成莽草酸［6］。

2 莽草酸的純度測(cè)定

紫外可見分光光度法測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)物中的莽草酸含量應(yīng)用比較廣泛，其操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，成為一種便捷可靠的分析方法。使用該法測(cè)量莽草酸濃度之前需要繪制出關(guān)于莽草酸的濃度以及對(duì)應(yīng)吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并列出線性回歸方程式。標(biāo)準(zhǔn)曲線以莽草酸的濃度為X軸，對(duì)應(yīng)的吸光值為Y軸，線性回歸方程的系數(shù)R2＞0.99。根據(jù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)：莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=3.0844X-0. 0048，系數(shù)R2=0.9999。

將微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物——發(fā)酵液收集起來(lái)，取定量發(fā)酵液，以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液，稀釋到合適的濃度，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)稀釋后的發(fā)酵液在245 nm處的吸光值，吸光值一般不要超過(guò)0.6。將吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可得出稀釋液的莽草酸濃度。

3 樹脂分離性能

生產(chǎn)出莽草酸后，分離純化是重要問(wèn)題。常用的分離提純法有：層析法、萃取法、離子交換樹脂法等。其中層析法、萃取法分離效率低，操作繁瑣，成本高，溶劑消耗量大［7］；而離子交換樹脂法設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，成本低，可以循環(huán)使用。綜合各方面原因離子交換樹脂法應(yīng)用更加廣泛。常用的樹脂有兩種：離子交換樹脂和大孔吸附樹脂，在使用之前兩種樹脂都需經(jīng)過(guò)預(yù)處理。前者樹脂交換能力由樹脂上活性基團(tuán)性質(zhì)決定；后者兩分子之間范德華力、氫鍵和接觸面積決定。

測(cè)定樹脂的分離性能時(shí)首先要明確影響吸附性能的外部條件，例如：溫度、上液濃度、樹脂高度、流速、洗脫液濃度等。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定同種樹脂在不同外部條件下的吸附性能；再測(cè)定不同樹脂在同種外部條件下的吸附性能。例如，717陰型離子交換樹脂吸附莽草酸時(shí)，在一定范圍內(nèi)，溫度影響吸附的效果不明顯，一般常用吸附溫度為24℃；洗脫液乙醇的濃度為95%，洗脫流速為1.4 mL/min，

4 展望

目前實(shí)際生產(chǎn)中，微生物發(fā)酵法也面臨自己的弊端，即工程菌的構(gòu)建以及發(fā)酵液中產(chǎn)物的純度問(wèn)題仍有待解決。微生物本身是一個(gè)有機(jī)生命體，改造工程菌并不是簡(jiǎn)單的事，切斷某一途徑很可能對(duì)微生物本身造成困擾，擾亂其正常生命機(jī)理。因此，通過(guò)構(gòu)建莽草酸工程菌提高產(chǎn)量和純度的研究仍需努力。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，相信科學(xué)家一定能夠構(gòu)建出適宜的工程菌，從而解決社會(huì)問(wèn)題。

［1］孫曉宇，韓麗萍，沈衛(wèi)榮，等.莽草酸產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件初步優(yōu)化［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，56（5）：33-35.

［2］張軍民，傅思武，石曉峰.微生物代謝合成法在莽草酸及其衍生物研究中的應(yīng)用［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（1）：91-93.

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