張依德 王遠亮

（重慶大學生物工程學院 重慶 400044）

MCM與核心組蛋白基因的負相關表達模式的初步探討

張依德 王遠亮

（重慶大學生物工程學院 重慶 400044）

本研究采用了熒光定量PCR技術，用穩(wěn)定表達的管家基因為內參基因，分析MCM及核心組蛋白家族基因負相關模式的動態(tài)表達情況，以探索它們之間的關系，以期為基因的負相關表達模式提供支持。結果顯示：兩組基因在細胞周期中不論何時上調或下調，只要一組基因出現(xiàn)上調，另一組基因總是出現(xiàn)下調的情況，也就是說兩組基因的表達模式總是相反的。Clb-Cdk1激酶在MCM基因和核心組蛋白基因的轉錄過程中扮演著極其重要的角色，它可以調控兩組基因的表達，是導致兩組基因呈負相關模式關鍵點。

釀酒酵母 負相關模式 細胞周期 熒光定量PCR

對于基因調控網(wǎng)絡的構建都是在識別相似表達基因或正相關表達基因的相互作用，而當前的研究發(fā)現(xiàn)，一個或多個基因表達的表達上調或者下調同時會導致其上游或下游一個或多個基因表達的改變，據(jù)此提出“負相關模式”這一概念。本課題組就此模式提出NCFCA算法，并將其應用于研究釀酒酵母細胞周期的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)微小染色體維持蛋白基因與核心組蛋白基因可能符合負相關模式概念。

對兩組基因進行GO功能富集分析，結果顯示它們都具有多種相似功能，主要體現(xiàn)在共同參與DNA構象變化、蛋白質-DNA復合物的組裝、細胞成分的組裝和合成等。因此我們對這兩組基因在酵母細胞周期中的表達情況進行具體探討與研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

實驗室野生型BY4743，W303A。

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，瓊脂粉；SYBR、RNA提取及反轉錄試劑盒；α因子；PCR儀、凝膠成像、PCR電泳儀系統(tǒng)；臺式高速冷凍離心機。

1.1.3 引物設計及合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的釀酒酵母的目標基因序列設計引物。1.2試驗方法

1.2.1 釀酒酵母細胞周期同步化

酵母細胞W303、BY4741于YPD培養(yǎng)基25℃水浴鍋中培養(yǎng)8-10個小時，然后再置于25℃有氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入α因子到培養(yǎng)基中，使其濃度為600ng/ml。在25℃有氧培養(yǎng)箱中孵育2小時候，水洗，重新加入到新鮮培養(yǎng)基中以有利于細胞重新進入有絲分裂。通過計數(shù)發(fā)芽細胞量及檢測芽的大小來評估酵母細胞同步化水平。

1.2.2 Total RNA的提取

酵母細胞經(jīng)同步化處理后每10min取樣一次，共取樣130min（約二個細胞周期）。使用試劑盒提取酵母總RNA，跑瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提取R NA的完整性。

1.2.3 全RNA反轉錄

使用試劑盒進行反轉錄。因每隔10分鐘取樣一次，RNA易降解，故采用兩步法進行反轉錄。所得基因組c D N A作為實時熒光定量PCR的檢測樣品。

將反轉錄得到的cDNA保存在—4℃冰箱中，可長期保存。

1.2.4 熒光實時定量RT-PCR

以反轉錄所得cDNA為模板，ACT1、ALG9為內參基因，實時定量PCR實驗檢測兩個家族共14個基因在三個細胞周期內的表達情況。

2 實驗結果

2.1 細胞周期同步化處理

經(jīng)α因子處理2h后，水洗加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每10分鐘取樣一次，顯微鏡下觀察計數(shù)酵母細胞發(fā)芽率及細胞核大小。統(tǒng)計結果顯示細胞基本處于細胞周期內同一階段，完成同步化處理，可進行后續(xù)實時定量PCR等實驗。

2.2 熒光實時定量PCR

選擇使用酵母菌ACT1及ALG9為內參基因，實時定量PCR檢測14個基因的表達變化情況。據(jù)內參基因表達量對比得出：隨著細胞周期的進行，MCM家族6個基因表達呈現(xiàn)出在酵母細胞周期內呈現(xiàn)出周期性的表達趨勢，從M期后期和G前1期開始，6個基因的表達水平逐漸上調直至最高表達水平，然后開始逐漸下調，到M期表達水平最低，然后隨著G1前期開始又重新開始上調；而組蛋白家族8個基因也呈現(xiàn)出周期性表達的趨勢，從G1期后期和S期前期開始，8個基因的表達呈下調的趨勢，到直到最低表達水平，隨后開始逐漸上調，到M期表達接近最高水平。

綜合比較兩組基因在細胞周期中的表達情況，發(fā)現(xiàn)不管上調或下調的時間，只要一組基因出現(xiàn)上調，另一組基因總是出現(xiàn)下調的情況，也就是說兩組基因的表達模式總是相反的。這一結果符合“負相關模式”這一概念，也就是說兩組基因為負相關模式。

3 討論

本實驗研究中酵母細胞M C M與組蛋白兩組基因在D N A復制起始及延伸過程中具有相似的同能，但在多個細胞周期內對兩組基因的表達的上調與下調同時改變，并出現(xiàn)相反表達模式?？紤]兩個基因之間能量守恒情況，當一個基因上調時，它必須要從另外一個基因獲取一部分能量，以維持上調，同時使得另外一個基因的表達下調。此外，同一通路中和兩個通路之間的基因也會存在負相關性，負相關基因具有一定的功能相似性。由此本課題組提出了兩個基因的負相關配對是一個全新的概念。

目前本研究對MCM與組蛋白這一對負相關配對基因形成的原因進行了理論數(shù)據(jù)及實驗分析，得出結果如下：

在M的后期和G1的前期，Clb-Cdk1抑制Yox1和Yhp1的表達，不再去抑制啟動子抑制蛋白Mcm1，從而使得MCM基因得以表達；與此同時，Clb-Cdk1則與其他細胞周期蛋白一起作用，招募RSC復合物以及HIR復合物做為抑制物結合到HTA1-HTB1的啟動子區(qū)，從而抑制組蛋白基因的轉錄。

在M/G1期之外，Clb-Cdk1不再抑制Yox1和Yhp1的表達，轉錄因子Mcm1與抑制子Yox1和Yhp1結合形成復合物，這兩個復合物再結合到MCM基因的啟動子區(qū)，進而抑制MCM基因的轉錄；同時，Clb-Cdk1與其他調控蛋白通過細胞周期信號以及磷酸化作用解除SWI和SNF對HIR復合物的抑制作用，使HIR復合物從共抑制子轉變成共激活子，從而激活組蛋白基因的轉錄。

以上事實表明：Clb-Cdk1在MCM基因和核心組蛋白基因的轉錄過程中扮演著極其重要的角色，它可以調控兩組基因的表達，是導致兩組基因呈負相關模式關鍵點，推測兩組基因可能同時參與細胞內同一生物過程，但是由于細胞內能量供求關系的平衡，所以兩者之間存在此消彼長的關系，即一組基因上調則另一組基因則下調。

Q75

A

1674-2060（2016）02-0325-01