張卉，王姣姣，任婷婷，金明朋，朱劍軍，張洪新，吳有盛

(1第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，西安710026；2國家腫瘤生物學重點實驗室·第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部教學實驗中心)

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線粒體靶向小清蛋白表達載體構(gòu)建及其對肝癌細胞線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的影響

張卉1，王姣姣2，任婷婷2，金明朋2，朱劍軍2，張洪新1，吳有盛2

(1第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，西安710026；2國家腫瘤生物學重點實驗室·第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部教學實驗中心)

摘要：目的構(gòu)建線粒體靶向小清蛋白(PVALB)表達載體，探討線粒體靶向PVALB在肝癌細胞(MHCC97H)中的表達及對線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的影響。方法 以骨骼肌細胞的cDNA為模板，通過PCR法擴增得到PVALB，經(jīng)酶切后與MTS、pcDNA3.1(+)載體連接；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切分析及測序鑒定后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染肝癌細胞MHCC97H，用激光共聚焦顯微鏡檢測PVALB定位及轉(zhuǎn)染后MHCC97H線粒體中鈣離子濃度。結(jié)果pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB經(jīng)酶切、測序鑒定完全正確，真核表達載體構(gòu)建成功；表達的MTS-PVALB定位于線粒體；MTS-PVALB可下調(diào)線粒體內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)論 成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB線粒體靶向真核表達載體，MTS-PVALB定位于MHCC97H線粒體并調(diào)節(jié)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)。

關(guān)鍵詞：肝腫瘤；小清蛋白；線粒體；鈣穩(wěn)態(tài)；載體構(gòu)建

線粒體的鈣穩(wěn)態(tài)在細胞中起著重要的生物學作用，與細胞的凋亡、有氧代謝和活性氧的產(chǎn)生等緊密相關(guān)，對胞質(zhì)內(nèi)鈣離子信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡途徑的激活都具有廣泛的調(diào)控作用。研究表明，鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)將導致線粒體功能異常，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1,2]。小清蛋白(PVALB)是細胞內(nèi)重要的水溶性鈣結(jié)合蛋白，是EF手臂鈣結(jié)合蛋白成員之一，對鈣離子具有高親和力[3]，能有效調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子交換，進而調(diào)控細胞生物學功能。線粒體靶向定位信號(MTS)，能夠引導蛋白進入線粒體。本研究擬通過構(gòu)建融合MTS的PVALB真核表達載體，探討其對肝癌細胞(MHCC97H)線粒體中鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1材料pcDNA3.1(+)載體、TRIzol、Lipofectamine2000、MitoTracker?Red CMXRos、Rhod-2 AM、PVDF膜購自Invitrogen公司；高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司； 胞質(zhì)線粒體分離試劑盒(C3601)購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗Parvalbumin (ab11427)多抗、羊抗兔二抗(ab6721)購自Abcam;限制性核酸內(nèi)切酶NheⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ、T4 DNA 連接酶、DNA marker DL2000購自TaKaRa公司；PCR所用的高保真DNA聚合酶購自TOYOBO公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega BIO-TEK公司；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker(SM 0671)購自Thermo Scientific公司；實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；MHCC97H購自上海中科院細胞庫；293T細胞由第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部教學實驗中心培養(yǎng)。

1.2目的基因獲取線粒體靶向序列按人細胞色素C氧化酶亞基Ⅷ相應(yīng)合成；PVALB序列以骨骼肌細胞cDNA為模板，PCR擴增獲取；EGFP擴增以pEGFP-N2質(zhì)粒為模板。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL、dNTPs(2 mmol/L) 5 μL、MgSO4(25 mmol/L) 3 μL、上下游引物各1.5 μL、KOD-Plus-Neo(1 U/μL) 1 μL、模板1 μL、去離子水32 μL。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性2 min、98 ℃變性10 s、68 ℃退火和延伸 30 s，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，按照DNA膠回收試劑盒說明操作，回收目的PVALB、EGFP DNA片段。

1.3pcDNA3.1(+)-PVALB、pcDNA3.1(+)-EGFP表達載體構(gòu)建回收的DNA片段及pcDNA3.1(+)載體用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切1 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收并定量。將酶切后的PVALB、EGFP DNA片段與pcDNA3.1(+)載體16 ℃連接過夜。將每個連接體系轉(zhuǎn)化50 μL的TOP10感受態(tài)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜。次日挑取平板中獨立的單克隆菌落，接種于5 mL含氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫搖床中，240 r/min過夜。收集3 mL菌液，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明提取質(zhì)粒并定量，并用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下片段與目的DNA大小一致的質(zhì)粒載體命名為pcDNA3.1(+)-PVALB和pcDNA3.1(+)-EGFP。

1.4靶向表達載體的構(gòu)建取構(gòu)建好的pcDNA3.1(+)-PVALB、pcDNA3.1(+)-EGFP表達載體，用NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切2 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，按照DNA膠回收試劑盒說明操作，回收酶切后的載體并定量。各取酶切后的載體與退火后的MTS 16 ℃連接過夜。 按照之前方法轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，并挑取單克隆菌落，擴增，提取重組后質(zhì)粒載體，用NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切1 h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下片段與目的DNA大小一致的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB、pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP。按上述方法，用BamHⅠ和NheⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB，插入EGFP序列，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB -EGFP真核表達載體。

1.5MHCC97H中MTS-PVALB融合蛋白表達定位將MHCC97H以5×105/孔接種于6孔板內(nèi)，24 h后使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(8 uL/孔)轉(zhuǎn)染融合表達pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP、pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB -EGFP載體(4 μg/孔)。24 h后消化、重懸、計數(shù)，再取適量細胞接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中。待細胞貼壁后，使用HBSS洗滌3次，在各培養(yǎng)皿底部加入200 μL濃度為250 nmol/L(用37 ℃預(yù)熱HBSS稀釋)Mito Tracker?Red 染料，37 ℃，染色25 min，HBSS清洗3次，使用Olympus (FV1000)共聚焦顯微鏡拍照。

1.6MHCC97H線粒體中MTS-PVALB融合蛋白定位檢測按照碧云天細胞線粒體分離試劑盒說明，提取轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB和pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP的MHCC97H細胞線粒體及去除線粒體的胞質(zhì)蛋白(細胞數(shù)約5×107個)，用150 μL細胞全蛋白裂解液(含Sodium Vanadate 2 mmol/L、Aprotinin 1 μg/mL、leupetin 1 μg/mL、PMSF 1 mmol/L)裂解提取的線粒體，胞質(zhì)蛋白和線粒體蛋白測定濃度。檢測時取等質(zhì)量蛋白上清25 μL，加5 μL 6×還原型上樣緩沖液煮沸10 min，使蛋白變性，12 000 r/min離心5 min，取上清和預(yù)染Marker用15%的SDS-PAGE凝膠加樣電泳，Western blotting法檢測蛋白。

1.7MHCC97H線粒體中鈣離子動態(tài)檢測將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP真核表達載體及轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB真核表達載體的MHCC97H分別接種于共聚焦專用培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，用濃度為 4 μmol/L的 Rhod-2 AM熒光染料，37 ℃染色30 min后，用HBSS清洗3次，再次置于37 ℃繼續(xù)孵育30 min。使用Olympus熒光顯微鏡檢測細胞，激發(fā)波長545 nm，發(fā)射波長565 nm。使用專用軟件，拍照設(shè)置間隔1張/s×500張，達到1 min基線后加入10 μmol/L組胺，記錄熒光強度曲線并加以分析。

2結(jié)果

2.1真核表達載體構(gòu)建結(jié)果PCR法擴增的PVALB 和EGFP片段的產(chǎn)物經(jīng)電泳后鑒定分別為330 bp 和720 bp，與預(yù)期大小一致。構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB、pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP、 pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB-EGFP經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小與預(yù)期大小一致，證明目的基因已成功連接到載體中，經(jīng)進一步測序確認，所構(gòu)建的載體序列、目的基因融合順序均正確。

2.2MTS-PVALB融合蛋白的定位情況MTS特異性地引導蛋白定位于線粒體。本實驗中構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)染細胞后，融合蛋白可正常表達。激光共聚焦顯微鏡拍照結(jié)果表明，表達的融合蛋白精確定位于線粒體中。

2.3PVALB對細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的影響表達MTS-PVALB融合蛋白的MHCC97H內(nèi)鈣離子濃度降低，在組胺誘導細胞內(nèi)鈣震蕩后，可很好地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，震蕩幅度變小，防止線粒體鈣超載。見圖1。

圖1　MTS-PVALB調(diào)節(jié)MHCC97H線粒體內(nèi)鈣濃度動態(tài)曲線

3討論

線粒體鈣穩(wěn)態(tài)與細胞的生物學功能密切相關(guān)，影響細胞的能量代謝和活性氧的產(chǎn)生，對胞質(zhì)內(nèi)鈣離子信號和震蕩發(fā)揮緩沖作用，調(diào)控細胞的凋亡途徑[4，5]。無論是分離的還是體內(nèi)的線粒體都可以自發(fā)吸收和釋放鈣離子，在維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)中起到非常重要的作用[6]。鈣超載容易導致線粒體損傷，誘導細胞凋亡和炎癥發(fā)生[7，8]，鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào)可導致線粒體功能紊亂，因此維持合適鈣離子水平對細胞正確發(fā)揮功能必不可少。

線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控涉及鈣的吸收、釋放和存儲。最近研究發(fā)現(xiàn)，定位于線粒體內(nèi)膜的分子線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運蛋白(MCU)及其受體(MCUR1)能夠正向調(diào)節(jié)線粒體鈣離子攝取，促進線粒體鈣離子內(nèi)流，提高線粒體對胞質(zhì)鈣離子的緩沖能力[9，10]。與Parvalbumin蛋白一樣，線粒體鈣離子調(diào)節(jié)蛋白具有兩個典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域，可感知鈣離子的變化，作為調(diào)控線粒體鈣攝入的重要分子，其表達與功能發(fā)揮是調(diào)節(jié)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。原發(fā)性肝癌組織中MCUR1蛋白表達異常增高，提示MCUR1異常表達可能與肝癌惡性發(fā)展相關(guān)。有研究也發(fā)現(xiàn)，線粒體鈣攝入減少能夠增強腫瘤細胞對于凋亡誘導劑的抵抗能力[11]。這些研究都反映了線粒體鈣穩(wěn)態(tài)與腫瘤發(fā)生相關(guān)。

Parvalbumin是細胞內(nèi)對鈣離子具有高親和力的鈣結(jié)合蛋白，是EF-hand鈣結(jié)合蛋白成員之一，是細胞內(nèi)鈣離子緩沖系統(tǒng)重要組成部分[12，13]，主要表達于骨骼肌細胞和少數(shù)神經(jīng)元細胞中。Parvalbumin在神經(jīng)元分布與γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的分布高度一致，可能與神經(jīng)沖動傳遞、短期突觸可塑性、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放等有關(guān)[14,15]。MTS能夠引導融合蛋白進入線粒體，本研究中構(gòu)建了MTS-PVALB融合蛋白真核表達載體，實現(xiàn)了目的蛋白定位于線粒體中，表達MTS-PVALB融合蛋白的細胞內(nèi)鈣離子濃度降低，在組胺誘導細胞內(nèi)鈣震蕩后，可很好地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，震蕩幅度變小，降低鈣波的傳播幅度和速度，防止線粒體功能異常。

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Construction of mitochondria targeted parvalbumin expressing vector and its effect on mitochondrial calcium homeostasis of hepatocellular carcinoma cells

ZHANGHui1,WANGJiaojiao,RENTingting,JINMingpeng,ZHUJianjun,ZHANGHongxin,WUYousheng

(1TangduHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710026,China)

Abstract:ObjectiveTo construct mitochondria targeted parvalbumin (PVALB) expression vector and to investigate the mitochondrial targeting PVALB expression in human hepatocellular carcinoma cells MHCC97H and its effect on mitochondrial calcium homeostasis. MethodsUsing skeletal muscle cells cDNA as the template, the PVALB was amplified by PCR, and then the digested PVALB was connected with MTS and pcDNA3.1 (+) vector. After identifying by enzyme digestion analysis and sequencing, the recombinant plasmid was transfected into MHCC97H by liposome. The expression and localization of PVALB, calcium concentration in MHCC97H were detected by laser scanning confocal microscopy after transfection. ResultspcDNA3.1 (+)-MTS-PVALB was successfully constructed and was verified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of MTS-PVALB was located in the mitochondria, and MTS-PVALB could down-regulate the concentration of calcium. ConclusionpcDNA3.1 (+)-MTS-PVALB was successfully constructed. The expressed MTS-PVALB was located in MHCC97H mitochondria and regulated mitochondrial calcium homeostasis.

Key words:liver neoplasms; parvalbumin; mitochondria; calcium homeostasis; vector construction

(收稿日期：2015-12-28)

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0004-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.002

通信作者簡介：張洪新(1966-)，男，博士，教授，主要研究方向為腫瘤防治。E-mail:zhhxtdjr@163.com吳有盛(1975-)，男，碩士，實驗師，主要研究方向為線粒體生物學及腫瘤防治。E-mail:wuys@fmmu.edu.cn

作者簡介：第一張卉(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤代謝。E-mail:grass1010@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81572727；81572304)。