CDH13表達下調(diào)對膀胱癌細胞遷移和侵襲及PI3K/Akt表達的影響

林英立　李艷麗　戚景光　馬建國　李文平　孫光

221005 徐州市腫瘤醫(yī)院泌尿外科(林英立、戚景光)；徐州市腫瘤醫(yī)院科教科(李艷麗)；河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(馬建國、李文平)；天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科(孫光)

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·實驗研究·

CDH13表達下調(diào)對膀胱癌細胞遷移和侵襲及PI3K/Akt表達的影響

林英立李艷麗戚景光馬建國李文平孫光

221005 徐州市腫瘤醫(yī)院泌尿外科(林英立、戚景光)；徐州市腫瘤醫(yī)院科教科(李艷麗)；河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(馬建國、李文平)；天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科(孫光)

【摘要】目的研究膀胱癌5637細胞中CDH13表達下調(diào)后對細胞遷移、侵襲和PI3K/Akt表達的影響以及它們間的關(guān)系。方法應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制人膀胱癌5637細胞株中CDH13的表達，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，Transwell 小室法檢測細胞侵襲能力，Western blot檢測CDH13、PI3K及Akt的表達水平。結(jié)果膀胱癌5637細胞中CDH13表達下調(diào)后細胞遷移和侵襲能力增強，PI3K及Akt的表達增加。結(jié)論膀胱癌細胞中CDH13表達下調(diào)可能通過激活PI3K/Akt通路促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。

【關(guān)鍵詞】膀胱癌；遷移；侵襲；CDH13

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來隨著暴露于危險因素的增加及人口的老齡化，其發(fā)病率呈上升趨勢[1-3]。CDH13是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因，其表達下調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)CDH13在膀胱癌組織中表達減少，并與腫瘤的分期、分級密切相關(guān)[5-8]。在本研究中我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制CDH13在膀胱癌5637細胞中的表達，檢測CDH13表達下調(diào)對腫瘤細胞遷移、侵襲及PI3K/Akt表達的影響，并探討它們之間的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

人膀胱癌5637細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫， RPMI 1640培養(yǎng)液購于美國Gibeo公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程公司，兔抗人CDH13多克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、CDH13 shRNA Plasmid、Control shRNA Plasmid購于美國Santa Cruz公司，HRP標記的羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司，MTT購自美國Sigma公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

二、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

5637細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。本研究分為3組，A：正常對照組(1×PBS)；B：陰性對照組(Control shRNA Plasmid)；C：實驗組(CDH13 shRNA Plasmid)。取對數(shù)生長期的5637細胞用胰酶消化并計數(shù)，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×105/ml，取500 μl接種于6孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80% 時進行轉(zhuǎn)染，操作按照LipofectamineTM2000 說明書進行，轉(zhuǎn)染后細胞板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細胞傳代培養(yǎng)，應(yīng)用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達 shRNA 的細胞，Western blot檢測CDH13基因的蛋白沉默效果[7-8]。

三、Western blot檢測蛋白表達

收集各組細胞，提取細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，用ECL發(fā)光劑檢測；各組以β-actin作內(nèi)參，將每個樣本的灰度值與內(nèi)參灰度值比較，得出的比值代表蛋白的含量。

四、細胞遷移能力檢測

應(yīng)用劃痕實驗檢測細胞遷移能力，在玻璃培養(yǎng)皿中心加入150 μl濃度為10 μg/ml的纖維蛋白，將細胞種植于培養(yǎng)皿中心部過夜，用200 μl槍頭尖端在培養(yǎng)皿細胞層劃痕，分別于不同時間段在顯微鏡下觀察、拍照,測量劃痕寬度的變化。

五、Transwell小室法檢測細胞侵襲能力

待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，消化細胞，用PBS和無血清培養(yǎng)液先后洗滌1次，用無血清培養(yǎng)液懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為1×105/ml，在下室(即24孔板底部)加入600 μl含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在上室加入150 μl細胞懸液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行觀察，計數(shù)基底膜下室的細胞數(shù)，顯微鏡下(400×)隨機選擇6個視野計數(shù)，取平均值為穿過基底膜的細胞數(shù)，細胞數(shù)代表其侵襲能力。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、RNA干擾抑制膀胱癌5637細胞CDH13蛋白的表達

shRNA轉(zhuǎn)染后實驗組CDH13蛋白表達水平明顯低于正常對照組和陰性對照組(圖1)；正常對照組、陰性對照組和實驗組的CDH13蛋白與內(nèi)參蛋白相對灰度值比分別為(1.182±0.046)、(1.158±0.055)、(0.187±0.015),實驗組與正常對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),正常對照組和陰性對照組間CDH13表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、CDH13表達下調(diào)對膀胱癌細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示CDH13表達下調(diào)后細胞遷移能力明顯增強，與正常對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖2)。

與正常對照組和陰性對照組比較*P<0.05

三、CDH13表達下調(diào)對膀胱癌細胞侵襲能力的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示CDH13表達下調(diào)后細胞侵襲能力明顯增強，與正常對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。正常對照組、陰性對照組和實驗組穿過慮膜的細胞數(shù)分別為(58.667±3.886)、(60.735±2.871)、(125.333±7.361)。

四、CDH13表達下調(diào)對膀胱癌細胞PI3K/Akt表達的影響

實驗組PI3K和Akt蛋白表達水平明顯高于正常對照組和陰性對照組(圖4)，實驗組與正常對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，正常對照組和陰性對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。正常對照組、陰性對照組和實驗組的PI3K蛋白與內(nèi)參蛋白相對灰度值比分別為(0.654±0.037)、(0.589±0.082)、(1.013±0.027)；正常對照組、陰性對照組和實驗組的Akt蛋白與內(nèi)參蛋白相對灰度值比分別為(0.469±0.033)、(0.437±0.051)、(0.768±0.061)。

討論

膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程，在危險因素的作用下癌基因的激活和抑癌基因的失活促進均參與其中[9-10]。CDH13是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因，CDH13基因定位于人染色體16q24，在許多腫瘤中人染色體16q24經(jīng)常發(fā)生突變、缺失以及啟動子甲基化等，進而影響基因所編碼蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)CDH13在多種腫瘤中表達減少或缺失，且CDH13表達下調(diào)與腫瘤的發(fā)生、增殖和侵襲等有著非常密切的關(guān)系[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中CDH13因其基因啟動子甲基化而表達減少，并且與膀胱癌的惡性生物學(xué)行為及不良預(yù)后有關(guān)[11-13]。CDH13是鈣粘蛋白家族的一員，其參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)許多生物加工過程，包括鈣介導(dǎo)的細胞黏附、細胞極性和形態(tài)形成，細胞的聚集和遷移，細胞的識別和信號傳導(dǎo)機制以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程[4]。然而，CDH13表達是通過何種機制促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的目前尚不清楚。

研究表明PI3K/Akt信號通路在大多數(shù)人類腫瘤中調(diào)節(jié)著腫瘤細胞的增殖和凋亡，并且與腫瘤的血管形成和侵襲、轉(zhuǎn)移以及對化療耐藥、放療抗拒密切相關(guān)，目前在腫瘤研究中備受關(guān)注[14]。激活的Akt重新定位到胞質(zhì)、核內(nèi)或細胞內(nèi)的其他部位，磷酸化相關(guān)的一些底物蛋白，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)在膽囊癌細胞中CDH13表達減少且伴隨著PI3K和Akt表達的增高，并且應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使CDH13在膽囊癌細胞中表達增高后可抑制PI3K和Akt的表達，CDH13可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)行為[15]。然而在膀胱癌中CDH13表達減少是否對PI3K和Akt的表達產(chǎn)生影響、是否通過PI3K/Akt途徑促進膀胱癌發(fā)展，目前尚無研究報道。因此在本研究中我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制CDH13在膀胱癌中的表達，并研究CDH13表達下調(diào)對細胞遷移、侵襲以及PI3K、Akt表達的影響，探討CDH13表達下調(diào)是否通過PI3K/Akt途徑促進膀胱癌發(fā)展，為膀胱癌的治療提供新的思路和理論依據(jù)。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使CDH13在膀胱癌5637細胞中表達減少后，細胞的遷移和侵襲能力明顯增強。我們的結(jié)果與以往在肝癌、乳腺癌及前列腺癌等腫瘤中的研究結(jié)果一致[4,16-18],并且，在膀胱癌細胞中CDH13表達減少后PI3K及Akt的表達明顯增加。研究表明CDH13低表達將導(dǎo)致多中心體細胞的出現(xiàn)，而Akt是參與調(diào)節(jié)中心體的主要蛋白激酶[14]。這些結(jié)果表明CDH13表達下調(diào)可能通過PI3K/Akt通路促進膀胱癌的發(fā)展。

綜上所述，在膀胱癌細胞中CDH13表達下調(diào)后細胞遷移和侵襲能力增強，并且PI3K及Akt表達明顯增加，這表明CDH13表達下調(diào)可能與PI3K/Akt通路有關(guān)。

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(本文編輯：熊鈺芬)

The influence of down-regulation expression of CDH13 on the migration, invasion and PI3K/Akt expression of bladder cancer cell

LINGYing-li*,LIYan-li,QIJing-guang,MAJian-guo,LIWen-ping,SUNGuang.

*DepartmentofUrology,XuzhouCancerHospital,Xuzhou221005,ChinaCorrespondingauthor:LINGYing-li,E-mail:lylxz2012@126.com

【Abstract】ObjectiveThe aim of this study was to investigate the influence of down-regulation expression of CDH13 on the migration and invasion of bladder cancer cell and PI3K/Akt expression, as well as the relationship between them. MethodsRNA interference was used to inhibit CDH13 expression in 5637 cells, wound healing was used to examine cell migration, Transwell was used to evaluate cell invasion, the expression of CDH13, PI3K and Akt was examined by Western blot. ResultsThe bladder cancer cell migration, invasion and PI3K/Akt expression was increased after the down-regulation of CDH13. ConclusionsDown-regulation expression of CDH13 in bladder cancer cell maybe promotes tumor cell migration and invasion through PI3K/Akt pathway.

【Key words】Bladder cancer;Migration;Invasion;CDH13

基金項目：徐州市醫(yī)學(xué)青年后備人才項目(2014007)；徐州市科技計劃項目(KC14SH015)；江蘇大學(xué)臨床科技發(fā)展基金項目(JLY20140109)；江蘇省“六大人才高峰”資助項目(2014-WSW-066)；江蘇省衛(wèi)計委青年科研課題項目(Q201514)

通信作者：林英立，E-mail:lylxz2012@126.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.01.009

(收稿日期：2015-12-23)