李霄鵬 王新昌 白秋蘭 雷 艷

益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥對干燥綜合征模型NOD小鼠TLR/IFN/BAFF通路的作用研究

李霄鵬1王新昌1白秋蘭2雷 艷2

目的觀察益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥對干燥綜合征（SS）模型NOD小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR9、IFN-α、BAFFmRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，探討其對SS的TLR-IFN-BAFF通路信號表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法選擇NOD小鼠20只及ICR正常小鼠10只，飼養(yǎng)于無特殊病菌的恒溫環(huán)境。NOD小鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組，各10只，ICR正常小鼠10只，作為對照組。于小鼠9周齡時(shí)開始每日定時(shí)灌胃益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥1次，持續(xù)12周。于實(shí)驗(yàn)第12周末時(shí)所有小鼠股動脈取血后處死，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測TLR9、IFN-α、BAFF mRNA表達(dá)水平。小鼠股動脈取血后處死，摘取小鼠頜下腺，用光鏡下觀察小鼠頜下腺病理改變。結(jié)果對照組、模型組、中藥組TLR9 mRNA表達(dá)水平分別為（0.15±0.03）、（0.92±0.05）、（0.29±0.06）；對照組、模型組、中藥組IFN-α mRNA表達(dá)水平分別為（0.12±0.03）、（1.48±0.04）、（0.20±0.03）；對照組、模型組、中藥組BAFF mRNA表達(dá)水平分別為（0.23±0.06）、（1.28±0.04）、（0.38±0.06）；與正常對照組相比，模型組TLR9、IFN-α、BAFFmRNA均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），與模型組比較，中藥組TLR9、IFN-α、BAFFmRNA均明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論NOD小鼠存在血清TLR9、IFN-α、BAFF mRNA水平過度表達(dá)。益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥對NOD小鼠TLR/IFN/BAFF通路的過度表達(dá)具有抑制作用。

NOD小鼠；干燥綜合征；性激素；益氣養(yǎng)陰祛瘀；中藥；TLR9；IFN-α；BAFF

干燥綜合征（sjogren syndrome，SS），是一種主要累及全身外分泌腺的慢性自身免疫性疾病，發(fā)病率較高[1]。屬于中醫(yī)“燥痹”范疇。益氣養(yǎng)陰祛瘀法是本課題組經(jīng)多年臨床應(yīng)用證實(shí)療效確切的中醫(yī)治療法則，前期研究[2-4]表明，不僅能整體調(diào)節(jié)SS患者和自發(fā)性干燥綜合征模型NOD小鼠的免疫功能，而且對SS患者口眼干燥的臨床癥狀和對NOD小鼠的唾液分泌量、頜下腺損傷指數(shù)以及局部免疫炎癥微環(huán)境也有明顯的改善作用?，F(xiàn)使用益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥對干燥綜合征樣小鼠治療NOD小鼠，通過檢測TLR9、IFN-α、BAFF的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步探討益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥對SS模型NOD小鼠TLR/IFN/BAFF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物20只NOD小鼠（動物合格證號：SCXK（滬）2007-0005）及10只ICR正常小鼠（SCXK（滬）2008-0016），雌性，8周齡，SPF級，均購自上海斯萊克動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥物益氣養(yǎng)陰祛瘀方由生地、玄參、麥冬、石斛、白芍、黃芪、丹參、益母草組成（購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥廠），冷水浸泡藥材2h，常規(guī)兩煎，第1次1.5h，第2次1h，兩次水煎液混合并過濾，經(jīng)水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥1.47g/mL的藥液，高壓滅菌后冷藏備用。

1.3 試劑PBS緩沖液，杭州吉諾生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞提取液，武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑（TaKaRa），大連寶生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒，大連寶生物工程有限公司；DNA-Marker，大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖，基因科技（上海）有限公司；引物（TLR、IFN、BAFF上下游引物），生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀（北京六一儀器廠），紫外分光光度儀（美國PE公司），低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司），PCR儀（德國Eppendorf公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海嘉鵬科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組8周齡NOD小鼠20只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為中藥組和模型組，每組10只；8周齡ICR正常小鼠10只作為對照組。

2.2 給藥與標(biāo)本采集于小鼠9周齡開始每天上午定時(shí)給藥1次，持續(xù)12周。其中中藥組給予益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥水煎劑0.2mL/10g灌胃（1.47g/mL）；模型組和對照組分別給予生理鹽水0.2mL/10g灌胃。給藥量均按動物與人等效劑量換算表計(jì)算。治療后各組小鼠股動脈取血后處死，摘取頜下腺進(jìn)行檢測。

2.3 RNA提取和RT-PCR檢測采用Trizol試劑提取NOD小鼠外周抗凝血中的總RNA后立即采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)。TLR9、IFN-α、BAFF基因序列經(jīng)循環(huán)擴(kuò)增30次；TLR9上下游引物序列分別為：上游：5'-CCTTGAT CTCCAACCGTAT-3'和5'-GTAGCAGTTCCCGTCCAT -3'；IFN-α上下游引物序列分別為：5'-GCATGGAAT ACAACCCCT-3'和5'-CCAGCACATTGGCAGA-3'；BAFF上下游引物序列分別為：5'-TCGTGGAATGGAT GAGTC-3'和5'-GGACATCGCTGTGAAACT-3'。PCR產(chǎn)物加溴酚藍(lán)后在70V電壓下經(jīng)加1%瓊脂糖凝膠電泳成像，與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，在紫外燈下觀察，出現(xiàn)橙紅色均一條帶為陽性。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)予β-actine引物作對照。用凝膠圖像分析軟件分析電泳條帶的吸光度（A）值，分別以TLR9、IFN-α、BAFF與βactinA值的比值×100%表示TLR9、IFN-α、BAFFmRNA的相對表達(dá)水平。

2.4 頜下腺組織病理學(xué)觀察三組小鼠處死后，分離頜下腺，以40%的多聚甲醛固定，經(jīng)酒精逐級脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，最后切成5μm厚的薄片，HE常規(guī)染色。光鏡下觀察頜下腺病理改變。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件包，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠頜下腺組織TLR9、IFN-α、BAFF表達(dá)水平比較與正常對照組比較，模型組TLR9、IFN-α、BAFF均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組TLR9、IFN-α、BAFF水平，明顯降低（P＜0.05）。見表1、圖1（插頁）。

3.2 各組小鼠頜下腺組織病理觀察結(jié)果正常對照組小鼠頜下腺間質(zhì)中未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)管未見擴(kuò)張。模型組小鼠頜下腺間質(zhì)可見淋巴細(xì)胞浸潤，部分為灶狀聚集，腺管周圍可見纖維增生，腺泡大小不均一。中藥組頜下腺間質(zhì)偶見淋巴細(xì)胞浸潤，未見腺體破壞（見插頁圖2）。

表1 各組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR9、IFN-α、BAFFmRNA表達(dá)水平比較（x±s）

4 討論

干燥綜合征是常見的結(jié)締組織病之一，其免疫病理本質(zhì)是患者在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，局部的非特異性感染等因素誘導(dǎo)引發(fā)一系列局部和全身的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致患者免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂、炎癥遷延，最終使得外分泌腺受到損傷。研究證實(shí)，TLR7、9在原發(fā)性干燥綜合征（primary sjo¨gren syndrome，pSS）患者腮腺組織中高表達(dá)[5]，pSS患者腮腺、血漿和血細(xì)胞中IFN-α的表達(dá)均呈上調(diào)趨勢[6]，pDC強(qiáng)烈表達(dá)TLR7和9，激活后可產(chǎn)生大量的IFN-α[7]。IFN-α刺激可使pSS患者涎腺上皮細(xì)胞和血液中單核細(xì)胞BAFF mRNA水平明顯增高[8-10]。綜上所述，TLRIFN-BAFF信號通路是貫穿疾病發(fā)生發(fā)展的重要致病軸，該信號通路的上調(diào)是SS發(fā)病的重要機(jī)制。通過抑制TLR-IFN-BAFF信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可有效阻止自身抗體和免疫復(fù)合物的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制SS自身免疫性炎癥反應(yīng)，減少發(fā)病或者減輕外分泌腺及其他相關(guān)系統(tǒng)的病理損傷。

NOD小鼠自發(fā)性涎腺炎通常從8周齡開始，16周齡開始出現(xiàn)明顯的唾液分泌功能降低，發(fā)病率雌性大于雄性，不僅與人類SS癥狀相似，還有著相似的組織學(xué)及免疫學(xué)特征，是研究人類SS較理想的動物模型[11-12]。

我們認(rèn)為燥毒、陰虧、瘀血為SS的主要病因，三者密切相關(guān)，相互促進(jìn)，使疾病纏綿難愈。益氣養(yǎng)陰祛瘀法合乎病機(jī)，臨床效果確切，副作用較少。

本研究結(jié)果顯示，益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥組NOD小鼠血TLR9、IFN-α、BAFFmRNA水平與模型組相比具有顯著差異，提示益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥能顯著降低NOD小鼠TLR9、IFN-α、BAFF mRNA表達(dá)水平。益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥可能通過下調(diào)TLR9、IFN-α、 BAFFmRNA表達(dá)，阻斷TLR9、IFN-α、BAFF之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控TLR-IFN-BAFF信號通路，發(fā)揮治療SS作用。

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（收稿：2016-05-30修回：2016-08-10）

Effects of Yiqi Yangyin Quyu Chinese Herbs on TLR/IFN/BAFF in NOD M ice w ith Sjogren Syndrome

LI Xiaopeng1,WANG Xinchang1,BAI Qiulan2,LEI Yan2.1 Department of Rheumatology,Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053)，China

Objective To observe the effect of Yiqi Yangyin Quyu（YYQ）Chinese medicine on the expression of TLR9,IFN-α,BAFF mRNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）of NOD mice with Sjogren syndrome, in an attempt to explore the underlying mechanism of YYQ Chinese medicine on the TLR-IFN-BAFF signal pathway of Sjogren syndrome.M ethods Twenty NOD mice and 10 ICR mice were used in this study.They were fed in the environment with constant temperature and without special bacteria.NOD mice were random ly divided into 2 groups：control group（n=10）and YYQ Chinese medicine group（n=10）.Ten ICR mice served as controls. All mice were given YYQ Chinese medicine once a day from 9 week old for 12 weeks.At the end of the 12th week,blood was drawn from the arteriae femoralis and the peripheral blood monocytes cell（PBMC）were isolated from the peripheral blood and examined by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）analysis for the mRNA expression of TLR9,IFN-α and BAFF.Mice were then killed after blood withdrawal to obtainsubmandibular glande for pathological examination under light microscopy.Results The mRNA level of TLR9,IFN-α and BAFF in control,model,and YYQ Chinese medicine groups were as follows：0.15±0.03,0.92±0.05,0.29±0.06; 0.12±0.03,1.48±0.04,0.20±0.03;0.23±0.06,1.28±0.04,0.38±0.06;the expression of TLR9,IFN-α and BAFF mRNA in model group were all higher than those in control group（P＜0.01 or P＜0.05）and those in YYQ Chinese medicine group（P＜0.05）.Conclusion Increased expression of serum TLR9,IFN-α and BAFF are observed inNOD mice.YYQ Chinese medicine can inhibit the overexpression of TLR/IFN/BAFF pathway.

NOD mice;Sjogren's syndrome;Yiqi Yangyin Quyu（strengthening Qi,nourishing Yin,reducing stasis）;Chinese medicine;TLR9;IFN-α;BAFF

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81173248）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕病科（杭州310005）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州310053）

王新昌，E-mail：ossani@126.com