硫酸慶大霉素中RNA和DNA的檢查

楊帆夏云空劉曉薇席德慧

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610042； 2.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司 四川成都 61000）

硫酸慶大霉素中RNA和DNA的檢查

楊帆1，2夏云空2劉曉薇2席德慧1

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610042； 2.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司 四川成都 61000）

目的 為檢查硫酸慶大霉素中的RNA與DNA，方法 先用凝膠柱色譜法分離出RNA與DNA，再采用改良苔黑酚法檢查RNA，采用二苯胺法檢查DNA。結(jié)果 RNA在1～20μg范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性回歸的相關(guān)系數(shù)r=0.9993，檢測限和定量限分別為0.28μg和0.85μg，平均回收率為96.1%；DNA在5～200μg范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性回歸的相關(guān)系數(shù)r=0.9995，檢測限和定量限分別為2.8μg和6.3μg，平均回收率為93.3%。結(jié)論 所建立的方法專屬、靈敏、準確，可用于硫酸慶大霉素中RNA 和DNA的檢查。

硫酸慶大霉素 RNA DNA 凝膠柱色譜法 改良苔黑酚法 二苯胺法

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

UV-1800PC 紫外-可見分光光度計（上海MAPADA）；

RNA對照品（酵母核糖核酸，中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所，含磷量大于7.0%）；

DNA對照品（小牛胸腺DNA，XIASI BIO公司生產(chǎn)）；

葡聚糖凝膠（Sephadex G-50）；

其他試劑均為分析純。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 RNA的檢查

采用改良苔黑酚法檢查本品中的RNA。改良苔黑酚法是利用RNA與鹽酸共熱，發(fā)生降解并生成糖醛，在銅離子的催化下，糖醛可與苔黑酚（3，5-二羥基甲苯）反應(yīng)，生成綠色產(chǎn)物，在670nm有最大吸收，采用比色法測定［2］。由于硫酸慶大霉素對檢查有干擾，采用凝膠柱色譜法分離出RNA后，再進行檢查。

1.2.1.1 測定方法

苔黑酚銅離子試液的配制：

試液A：稱取苔黑酚5.0g，，溶解于10ml 95%的乙醇中，搖勻；

試液B：稱取氯化銅0.15g，溶解于100ml濃鹽酸中，搖勻；

臨用前，量取試液A 1ml 與試液B 100ml，混勻，即得。

對照品溶液的制備：準確稱取RNA對照品10.0mg，置10ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，即得。（0.01mg/ml）

凝膠柱的制備：取葡聚糖凝膠（Sephadex G-50）20g，加水適量使溶脹，用水沖洗數(shù)次，裝于玻璃柱（25×1.5cm；有效柱長約16. 5cm）內(nèi)，待凝膠自然沉降完全后，加3倍于柱體積的水洗滌，備用。

供試品溶液的制備：稱取硫酸慶大霉素樣品1.0g，置10ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，再加水稀釋至刻度，搖勻（100mg/ml）；量取上述溶液1.0ml，加于預(yù)先裝好的凝膠柱上，以水為洗脫劑洗脫，流速為0.25ml/min，棄去初流出液8ml，收集續(xù)流出液8ml，備用。

測定方法：按下表配制好溶液后，同置沸水浴內(nèi)加熱35min，放冷后，以6號管為空白，在670nm波長處測定吸光度，用標準曲線法計算樣品中R N A的含量。

1.2.1.2 方法的考察

（1）線性和范圍

按1.2.1.1項下方法配制不同濃度的對照品溶液，測定吸光度，以吸光度（A）對RNA的量（X）進行線性回歸， 結(jié)果表明，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

（2）檢測限和定量限

采用空白信號標準差法測定。取空白溶液，重復(fù)測定3次，測得吸光度分別為0.001、0.000和0.000。計算得空白信號標準差σ為5.8× 10-4。

表1 RNA的測定方法 單位：ml

表2 RNA測定回收試驗的結(jié)果

表3 樣品中RNA的測定結(jié)果

表4 DNA的測定方法 單位：ml

表5 DNA測定回收試驗的結(jié)果

表6 樣品中DNA的測定結(jié)果

（3）回收試驗 準確稱取已測定RNA含量的硫酸慶大霉素1.0g，加入高低兩種濃度的RNA對照品溶液，按1.2.1.1項下方法測定RNA的含量，并計算回收率，結(jié)果見下表：

1.2.1.3 樣品中RNA的測定

稱取硫酸慶大霉素1.0g，按1.2.1.1項下的方法測定，結(jié)果見下表：

1.2.2 DNA的檢查

采用二苯胺法檢查本品中的DNA。二苯胺法是利用DN A在酸性溶液中加熱降解，生成2’-脫氧核糖并形成ω-羥基-γ-酮基戊醛，后者與二苯胺試劑反應(yīng)，生成藍色化合物，在595nm有最大吸收，采用比色法測定［2］。由于硫酸慶大霉素對檢查有干擾，所以采用凝膠柱色譜法分離出DNA后，再進行檢查。

1.2.2.1 測定方法

二苯胺試液的配制：

試液A：稱取二苯胺0.4g，加冰醋酸90ml使溶解，加高氯酸4ml，混勻；

試液B：量取40%的乙醛溶液1.0ml，加水稀釋至25ml，混勻；

臨用前取A液，加B液0.4ml，混勻，即得。

對照品溶液的制備：準確稱取DNA對照品10.0mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度；精密量取上述溶液1ml，置10ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，即得。（0.1g/ml）

凝膠柱的制備與供試品溶液的制備：同1.2.1 RNA測定項下。

測定方法：按下表配制好溶液后，置60℃水浴中加熱1.5h，放冷，以6號管為空白，于595nm波長處測定吸光度，用標準曲線法計算樣品中D N A的含量。

1.2.2.2 方法的考察

（1） 線性和范圍 按1.2.2.1項下方法配制不同濃度的對照品溶液并測定吸光度，以吸光度對DNA的量進行線性回歸，結(jié)果表明，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

（2） 檢測限和定量限

空白信號的測定：采用空白信號標準差法測定。取空白溶液（同1項下的9#溶液），重復(fù)測定3次，測得吸光度分別為0.000、0.001和0.000。計算得空白信號標準差σ為5.8×10-4。

（3）回收實驗：準確稱取已測定DNA含量的硫酸慶大霉素1.0g，加入高低兩種濃度的DNA對照品溶液，按1項下方法測定DNA的含量，并計算回收率，結(jié)果見表7：

1.2.2.3 樣品中DNA的測定

稱取硫酸慶大霉素1.0g，按1.2.2.1項下的方法測定，結(jié)果如下：

1.3 討論

1.3.1 由于硫酸慶大霉素對檢查有干擾，所以采用凝膠柱色譜法分離出核酸后，再進行檢查。選擇葡聚糖凝膠（Sephadex G-50）進行分離，RNA和DNA分子量較慶大霉素大，在分離過程中為全排阻，首先被洗脫。分別取核酸對照品溶液和硫酸慶大霉素溶液，加于葡聚糖凝膠柱上，收集洗脫液，用紫外分光光度法監(jiān)測，確定組分的保留體積。結(jié)果表明，在實驗條件下，死體積約為8ml，兩種核酸在隨后的8ml內(nèi)被洗脫，慶大霉素隨后被洗脫，核酸和慶大霉素可以完全分離。

［1］華維一.藥物化學(xué)［S］. 北京：高等教育出版社，2004.

［2］趙亞華.生物化學(xué)實驗技術(shù)教程.廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000.

Determination of RNA and DNA in Gentamicin Sulfate

YANG FAN1，2
（1.College of live scienen Sichuan university，Chengdu， 610041 China；2.Chengdu rongshen pharmaceuticals co.， Chengdu，610000 China）

Objective： To determine RNA and DNA in Gentamicin Sulfate， Methods： RNA and DNA were separated by gel chromatography and determined with improved orcinol colorimetry and diphenylamine colorimetry， respectively. Results： For RNA determination， the linear range was 1～20 μ g （r=0.9993）. LOD and LOQ were 0.28μg 0.85μg， respectively. The average recovery was 96.1%. For DNA determination， the linear range was 5～200 μg （r=0. 9995）. LOD and LOQ were 2.8μg 6.3μg， respectively. The average recovery was 93.3%. Conclusion： The methods were specific， sensitive， accurate and suitable for determination of RNA and DNA in Gentamicin Sulfate.

Gentamicin Sulfate； RNA； DNA； Gel chromatography； Improved orcinol colorimetry； Diphenylamine colorimetry

R917

A

1674-2060（2016）02-0166-02

楊帆，男，漢族，現(xiàn)從事于血液制品行業(yè)，就職于成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，具有多年的生產(chǎn)工作經(jīng)驗，同時為四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2012級在職研究生。