于金芝，徐峰，徐瑩*

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266003)2(大連市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 大連，116021)

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高鹽稀態(tài)醬油生產(chǎn)過程中的生物胺變化規(guī)律

于金芝1，徐峰2，徐瑩1*

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266003)2(大連市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 大連，116021)

采用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定4種市售高鹽稀態(tài)醬油中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺8種生物胺的含量，并監(jiān)測(cè)了其中一種醬油生產(chǎn)過程中生物胺含量和生物胺產(chǎn)生相關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，市售醬油總生物胺含量差別較大，范圍為102.87～760.28 mg/kg，但均以酪胺、組胺和苯乙胺為主。醬油發(fā)酵過程中，大部分生物胺表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，即發(fā)酵前期快速升高，在50～60 d左右達(dá)到峰值，再逐漸降低，酪胺和組胺是醬油發(fā)酵過程中的主要生物胺，最高含量分別達(dá)到2 417.36 mg/kg和815.89 mg/kg。氨基酸態(tài)氮前期變化趨勢(shì)與總生物胺含量變化基本一致，之后趨于穩(wěn)定；pH值降低有利于生物胺的形成，最低時(shí)生物胺含量達(dá)到峰值。結(jié)果表明，在市售醬油和不同發(fā)酵時(shí)期醬油中生物胺的含量情況不容樂觀，需加以研究與關(guān)注。

生物胺；醬油；高效液相色譜法；動(dòng)態(tài)變化

醬油是以豆粕、小麥、麩皮等為原料，經(jīng)多種微生物發(fā)酵制成的具有特殊色、香、味的調(diào)味品[1]。醬油是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，原料中的各種物質(zhì)在微生物酶的催化下水解成氨基酸等成分，不同成分之間相互組合、多級(jí)轉(zhuǎn)化，造就了醬油獨(dú)特的風(fēng)味口感，但因?yàn)槠浒l(fā)酵周期較長(zhǎng)且過程復(fù)雜，就可能會(huì)產(chǎn)生一些潛在的有害物質(zhì)，生物胺就是其中的一類。

生物胺是一類具有生物活性的低分子量含氮有機(jī)化合物的總稱，在食品中主要是由微生物的氨基酸脫羧酶對(duì)游離氨基酸脫酸反應(yīng)產(chǎn)生的[2]。生物胺廣泛存在于食品尤其是醬油、酒類等發(fā)酵食品中，主要有組胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺[3]。生物胺對(duì)維持細(xì)胞正常的生理功能有一定作用[2]，但是，當(dāng)機(jī)體攝入高濃度的生物胺時(shí)，會(huì)導(dǎo)致身體產(chǎn)生頭痛、惡心、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)[3]。其中，組胺和酪胺的毒性最大。美國(guó)FDA對(duì)于水產(chǎn)品中組胺的含量限制為50 mg/kg[4]，將500 mg/kg定為危險(xiǎn)水平，并且論證了所食用的魚類中有超過1 000 mg/kg的組胺就會(huì)產(chǎn)生中毒[5]；口服酪胺超過100 mg會(huì)引起偏頭痛，超過1 080 mg就會(huì)引起中毒性腫脹食[6]。

近幾年對(duì)醬油中生物胺的研究逐步增多，但是主要集中于成品市售醬油中生物胺的檢測(cè)。到目前為止，有關(guān)醬油發(fā)酵過程中生物胺含量的變化規(guī)律的報(bào)道還較少。有研究顯示，在已檢測(cè)的成品醬油中普遍存在8種生物胺，有少部分醬油中的總生物胺甚至超過了1 000 mg/kg[7-10]。醬油是我國(guó)以及亞洲范圍內(nèi)廣泛食用的調(diào)味品，在人們的日常生活中占據(jù)重要地位，因此，有必要對(duì)其整個(gè)發(fā)酵過程中生物胺的形成和變化規(guī)律進(jìn)行研究。本文在測(cè)定4種市售的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺含量的基礎(chǔ)上，監(jiān)測(cè)了其中一種醬油生產(chǎn)過程中8種生物胺含量的變化規(guī)律，并分析了可能與生物胺產(chǎn)生相關(guān)指標(biāo)的變化，以期為今后醬油發(fā)酵過程中生物胺關(guān)鍵控制點(diǎn)的確定提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在青島某超市隨機(jī)購(gòu)買保質(zhì)期內(nèi)的4個(gè)不同品牌的高鹽稀態(tài)醬油，即A(山東省煙臺(tái)市)、B(山東省煙臺(tái)市)、C(廣東省江門市)、D(山東省青島市)，首次采樣前未打開包裝。不同時(shí)期的醬油發(fā)酵樣品由青島某釀造有限公司提供，取樣于50mL無菌聚丙烯酰胺小瓶，-20 ℃冷凍待檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)品組胺、腐胺、精胺和亞精胺以及衍生劑丹磺酰氯，購(gòu)自Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)品色胺、苯乙胺、尸胺和酪胺，購(gòu)自Aldrich公司；其中，組胺、腐胺和尸胺分別為組胺二鹽酸鹽、腐胺二鹽酸鹽和尸胺二鹽酸鹽形式。甲醇為色譜純，購(gòu)自Merck公司；水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；HCl、丙酮等其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用0.1mol/L HCl將8種生物胺精確配成100 mg/L(均以生物胺的單體形式計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封后4℃避光保存。

混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：用0.1 mol/L HCl將混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋為1.00、2.50、5.00、10.00、15.00、25.00和50.00 mg/L，4 ℃避光保存。

Dns-Cl衍生劑：以丙酮為溶劑將Dns-Cl配制成10 mg/mL衍生劑，4 ℃避光保存。

pH11.0緩沖液：將0.5 mol/L NaHCO3和0.5 mol/L Na2CO3，按照體積比25∶6混合均勻，然后用Na2CO3調(diào)節(jié)pH至9.2，4 ℃保存。每50 mL上述緩沖液中加入16.65 g K2CO3，緩沖液的pH值即為11.0～11.1，必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定市售成品醬油中的生物胺含量

準(zhǔn)確稱取2.00 g醬油于10 mL離心管，加入6 mL 0.1 mol/L HCl，旋渦混合，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清定容到10 mL，即為生物胺提取液。

生物胺衍生步驟：移取1.00 mL生物胺提取液于10 mL離心管，加入1.50 mL pH11.0的緩沖液，混合均勻；然后再加入1.00 mL Dns-Cl，40 ℃水浴暗反應(yīng)1 h；加入0.20 mL脯氨酸溶液，混合均勻，室溫保持1 h；加入3.00 mL正庚烷萃取，旋渦混合，分層后取1.00 mL上層有機(jī)相，40 ℃下氮?dú)獯蹈?；加?.00 mL色譜純甲醇溶解殘留物，過0.22 μm有機(jī)膜，待上機(jī)測(cè)定。

表1 生物胺分析的梯度洗脫程序

高效液相色譜儀的測(cè)定條件：參照J(rèn)IANG等[11]的方法并適當(dāng)調(diào)整。Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；色譜柱Capcell Pak C18MGⅡ(4.6 mm I.D.×150 mm，5 μm)，日本資生堂；流速0.80 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣體積20μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。洗脫程序見表1。

1.2.2 測(cè)定醬油發(fā)酵過程中生物胺含量變化

分別稱取2.00 g醬油D的不同時(shí)期發(fā)酵樣品于10 mL離心管，加入6 mL 0.1 mol/L HCl，漩渦混合，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清于25 mL容量瓶，剩余沉淀再次加入HCl重懸，同樣條件離心，合并上清液于容量瓶，定容，即為生物胺提取液。衍生步驟和測(cè)定條件見1.2.1。

1.2.3 pH值

使用PHSJ-3F數(shù)字pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定。

1.2.4 氨基酸態(tài)氮含量

使用ZDJ-4A型自動(dòng)電位滴定儀(上海儀分科學(xué)儀器有限公司)，采用甲醛滴定法測(cè)定發(fā)酵樣品中的氨基酸態(tài)氮(AAN)含量，結(jié)果以mg/100g發(fā)酵樣品表示[7]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的形式表示；使用Origin Pro8.1軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物胺分析方法的確認(rèn)

表2為色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺線性方程與相關(guān)系數(shù)，8種待測(cè)生物胺在1.00～50.00 mg/L的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。

表2 生物胺的線性方程與相關(guān)系數(shù)

圖1A為生物胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生后的液相色譜圖，8種生物胺的峰形對(duì)稱、尖銳，而且能達(dá)到較好的分離度；圖1B是某醬油樣品經(jīng)0.1 mol/L的HCl提取、Dns-Cl衍生后的液相色譜圖，前15 min主要用于雜質(zhì)的分離，保留時(shí)間15～33 min之間，主要是8種待測(cè)生物胺的色譜峰，保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，不會(huì)影響各生物胺的定性分析。

圖1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品(A)和一種醬油(B)的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the derivatives of biogenic amines(A) and extracts of one soy sause (B)

2.2 4種市售醬油中生物胺含量分析

4種市售醬油產(chǎn)品中8種以及總生物胺含量見圖2，所測(cè)產(chǎn)品普遍含有測(cè)定的8種生物胺，但不同品牌醬油的生物胺種類和含量差異較大。

醬油C、醬油A和醬油D含有較高濃度的生物胺，總生物胺濃度分別為760.28 mg/kg、684.80 mg/kg和328.27 mg/kg，而醬油B的生物胺含量相對(duì)較低，總生物胺濃度僅為102.87 mg/kg。醬油C含量最高的為酪胺(399.37 mg/kg)，其次為組胺(188.03 mg/kg)和苯乙胺(66.43 mg/kg)；醬油A含量最高的為組胺(336.50 mg/kg)，其次為酪胺(260.80 mg/kg)和苯乙胺(51.80 mg/kg)；醬油D含量最高的為酪胺(94.33 mg/kg)，其次為組胺(86.44 mg/kg)和苯乙胺(77.34 mg/kg)；而醬油B含量最高的亞精胺僅為40.27 mg/kg。由此可知，除了醬油B，醬油中普遍含有較高濃度的酪胺、組胺和苯乙胺，其他五種生物胺的濃度則相對(duì)較低。這與鄒陽[8]、LU[9]等的報(bào)道基本一致。醬油中高含量的酪胺可能與醬油生產(chǎn)原料豆粕中高含量的酪氨酸有關(guān)。研究表明，酪胺和苯乙胺是由醬油生產(chǎn)過程中的腸球菌等微生物生成的[12]。也有研究表明，高含量的酪胺與腐胺和尸胺的含量比較高有關(guān)，也可能與醬油整個(gè)生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生狀況有關(guān)[12]。

圖2 市售醬油產(chǎn)品中生物胺含量Fig.2 Biogenic amines content of commercial soy sauces

過量的組胺攝入會(huì)使人體產(chǎn)生頭暈、頭疼、嘔吐等癥狀，大部分關(guān)于生物胺的標(biāo)準(zhǔn)也是針對(duì)組胺，F(xiàn)DA規(guī)定水產(chǎn)品中組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)為50 mg/kg[4]。由圖2可知，檢測(cè)的4種醬油中，有3種組胺含量遠(yuǎn)高于此標(biāo)準(zhǔn)，醬油A的組胺含量甚至達(dá)到336.50 mg/kg，這可能與醬油開放式的發(fā)酵環(huán)境以及發(fā)酵菌群組胺生成能力較強(qiáng)有關(guān)。有研究表明，酪胺含量超過100 mg/kg的食品會(huì)危害人體健康[2]。在測(cè)定的4個(gè)醬油樣品中，有2個(gè)醬油產(chǎn)品的酪胺含量超過了100 mg/kg。生物胺中組胺對(duì)人類影響最大，其次是酪胺[14]，因此，有必要對(duì)醬油中的組胺和酪胺進(jìn)行監(jiān)測(cè)。有研究表明，食品中總生物胺含量大于1 000 mg/kg會(huì)對(duì)人體造成傷害[2]。由圖2可知，所測(cè)4個(gè)醬油樣品總生物胺的含量范圍在102.87～760.28 mg/kg，均未超過1 000 mg/kg。

綜上所述，8種生物胺在所測(cè)市售醬油中普遍存在，醬油發(fā)酵體系中的生物胺產(chǎn)生菌、豐富的游離氨基酸以及相對(duì)適宜的環(huán)境導(dǎo)致生物胺的大量產(chǎn)生。醬油具備獨(dú)特的風(fēng)味及豐富的氨基酸組成，是中國(guó)和亞洲其它很多國(guó)家日常使用的調(diào)味料，但是長(zhǎng)期大量攝入生物胺會(huì)對(duì)身體造成較大的損害。因此，分析醬油發(fā)酵過程中生物胺的產(chǎn)生過程，可為今后醬油發(fā)酵過程中生物胺關(guān)鍵控制點(diǎn)的確定提供重要依據(jù)。

2.3 醬油發(fā)酵過程中生物胺含量變化

本研究分析了青島某醬油不同發(fā)酵時(shí)期生物胺含量的變化，結(jié)果見圖3。

圖3 醬油發(fā)酵樣品過程中生物胺含量變化Fig.3 Changes of biogenic amine content in soy sauce during different fermentation periods

色胺、腐胺：兩種生物胺的變化趨勢(shì)基本一致，在醬油發(fā)酵期的前14天，幾乎檢測(cè)不到，從第21天開始，含量急劇上升，分別在第54天和在第61天達(dá)到最高(分別為364.60 mg/kg和234.44 mg/kg)，之后快速下降，在第117天之后又緩慢上升，最終含量分別為50.82 mg/kg和60.35 mg/kg。

苯乙胺、酪胺：兩種生物胺變化趨勢(shì)極為相似，在醬油發(fā)酵前期幾乎檢測(cè)不到，從第21天開始，含量先緩慢上升，之后急劇上升，在第61天達(dá)到最高，分別為298.95 mg/kg和2417.36 mg/kg，之后呈先急后緩下降趨勢(shì)，最終含量分別為24.59 mg/kg和111.67 mg/kg。酪胺是醬油發(fā)酵中期含量最高的生物胺，且遠(yuǎn)高于其它種類生物胺，最終濃度超出了FDA規(guī)定的100 mg/kg。

組胺：組胺在前期的變化與苯乙胺相似，在第61天含量達(dá)到最高，為815.89 mg/kg，最終濃度為535.00 mg/kg。組胺的含量?jī)H次于酪胺，也超過了FDA的限量標(biāo)準(zhǔn)50 mg/kg。酪胺和組胺是醬油發(fā)酵體系中兩種最主要的生物胺，這與成品醬油的生物胺含量一致。

尸胺：尸胺在整個(gè)發(fā)酵過程中含量變化最不明顯，發(fā)酵前期含量在30 mg/kg上下波動(dòng)，第60天之后，含量緩慢上升，最終含量為50.90 mg/kg。

亞精胺和精胺：兩種生物胺前期變化整體呈上升趨勢(shì)，分別在第117天和第214天達(dá)到最高，分別為93.90 mg/kg和269.88 mg/kg，亞精胺含量在第117天之后略有下降，而精胺含量一直上升。

醬油發(fā)酵過程中，總生物胺含量在前14天變化不明顯，之后快速上升，在第49天超過1 000 mg/kg，達(dá)到1238.31 mg/kg，之后急劇升高，在第61天時(shí)達(dá)到最高濃度，為4 405.29 mg/kg，之后總生物胺含量急劇下降，在第117天時(shí)降至1 249.96 m/kg，第117天之后下降趨勢(shì)緩慢，最終含量為1 187.63 mg/kg。在整個(gè)發(fā)酵過程中，酪胺和組胺的含量遠(yuǎn)高于其它6種生物胺，所以，酪胺和組胺的變化趨勢(shì)在很大程度上決定了總生物胺的變化趨勢(shì)。

醬油發(fā)酵前期生物胺含量未顯著增加，可能與該時(shí)期體系中游離氨基酸含量較低有關(guān)。微生物產(chǎn)生的胞外酶將蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)水解為多肽、氨基酸等，此時(shí)可以產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物才可以利用游離氨基酸并且在適宜的條件下將其轉(zhuǎn)化為生物胺。因此，在60天左右時(shí)，生物胺的總含量達(dá)到高峰。之后，總生物胺濃度逐漸下降，可能是因?yàn)榘l(fā)酵體系的環(huán)境不適合生物胺產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)，生物胺降解菌轉(zhuǎn)而占據(jù)優(yōu)勢(shì)。影響生物胺生成的因素有很多，如原料中大豆的含量，微生物的組成，發(fā)酵周期等[15]，因此，生物胺的形成和變化規(guī)律是這些因素共同作用的結(jié)果。

2.4 醬油發(fā)酵過程中常規(guī)理化指標(biāo)變化

如圖4所示，氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵前期變化不明顯，之后快速升高，在第50天左右時(shí)達(dá)到峰值，之后趨于平緩，變化趨勢(shì)與總生物胺含量基本一致，且達(dá)到峰值的時(shí)間稍早于生物胺達(dá)到峰值的時(shí)間。當(dāng)醬油發(fā)酵體系中含有大量前體氨基酸時(shí)，可以產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物就會(huì)在適宜條件下將氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)生物胺。氨基酸態(tài)氮在一定程度上反映了氨基酸的含量，因此，發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化與生物胺的含量具有一定相關(guān)性[6]。

如圖4所示，醬油發(fā)酵過程中體系的pH值變化趨勢(shì)為發(fā)酵前期呈下降趨勢(shì)，在第50天左右時(shí)降到最低，pH值約為5.3，之后緩慢上升，發(fā)酵結(jié)束最終pH約為5.9。pH值是影響醬油中生物胺產(chǎn)生的重要因素之一。KOESSLER等[16]研究表明，胺的形成是細(xì)菌為抵抗酸性環(huán)境的做出的生理反應(yīng)[6]。有研究指出，細(xì)菌的氨基酸脫羧酶在酸性環(huán)境下活力更強(qiáng)，因此低pH值能提高細(xì)菌產(chǎn)生生物胺的能力[2]。由此可以推斷，在醬油發(fā)酵體系pH值下降過程中，生物胺的含量逐漸積累，并在pH值降到最低之后達(dá)到峰值。

圖4 醬油發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量和pH值變化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen content and pH in soy sauce during different fermentation periods

3 結(jié)論

本文采用Dns-Cl柱前衍生HPLC法同時(shí)測(cè)定了醬油中8種生物胺的含量。醬油中的生物胺以組胺、酪胺和苯乙胺為主，總生物胺的含量均超過了100 mg/kg。所測(cè)醬油發(fā)酵過程中色胺、苯乙胺、腐胺、組胺和酪胺的變化趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵前期明顯升高，50～60 d左右時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸降低；尸胺含量在發(fā)酵過程中變化不大；亞精胺和精胺含量在發(fā)酵過程中逐漸上升并趨于穩(wěn)定，無明顯下降趨勢(shì)；氨基酸態(tài)氮前期變化趨勢(shì)與總生物胺含量變化基本一致，之后趨于穩(wěn)定；pH值降低有利于生物胺的形成，最低時(shí)生物胺含量達(dá)到峰值。

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Analysis on the change rule of biogenic amines during the process of high-salt diluted soy sauce

YU Jin-zhi1,XU Feng2,XU Ying1*

1(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China) 2(Dalian Municipal Center for Disease Control and Prevention, Dalian 116021, China)

Eight biogenic amines including tryptamine, phenylethylamine, putrescine, cadaverine, histamine, tyramine, spermidine and spermine in commercial high-salt diluted soy sauce were determined by the high performance liquid chromatography using pre-column derivatization with dansylchloride. The changes of biogenic amine content and the related indexes in the fermentation process of one soy sauce were also studied. The results showed that the total content of eight biogenic amines in commercial soy sauce was ranged from 102.87-760.28 mg/kg. Tyramine, histamine and phenylethylamine were regarded as the main biogenic amines in the soy sauce. Most of the biogenic amines exhibited similar tendency of increase first and then decrease in the fermentation process of soy sauce with maximum values observed between fifty and sixty days. Histamine and tyramine were regarded as the main biogenic amines in the fermentation process of soy sauce, with highest contents of 815.89 mg/kg and 2 417.36 mg/kg, respectively. The content of amino acid nitrogen showed similar tendency with the total biogenic amines in early period of fermentation. The descending of pH was beneficial to the formation of biogenic amines, which peaked when pH reached its lowest value. The results suggested that the situation of biogenic amines in commercial soy sauce and the fermentation process was not optimistic, and needed more studies and attention.

biogenic amines;soy sauce;high performance liquid chromatography;dynamic change

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610008

碩士研究生(徐瑩副教授為通訊作者,E-mail: xuy@ouc.edu.cn )。

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD17B02-1)；國(guó)家自然科學(xué)基金(U1406402-5)

2016-05-03，改回日期：2016-05-20