張 升，楊 林，2，由振強(qiáng)，辛艷飛

（1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心，浙江杭州 310013；2.浙江工業(yè)大學(xué)長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310014）

多柔比星（doxorubicin）是臨床上廣泛使用的一種廣譜高效的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，但因其具有心臟毒性而在臨床應(yīng)用中受到限制。多柔比星致心臟毒性的機(jī)制尚不完全清楚，通常認(rèn)為與心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡等機(jī)制相關(guān)［1］。細(xì)胞自噬是一類依賴于溶酶體的蛋白質(zhì)降解途徑。研究表明，自噬在多柔比星所致心臟毒性中具有重要作用，自噬既可能對(duì)一些心肌病變具有一定的保護(hù)作用，也可能使一些心肌損傷更加惡化［2］。本文回顧多柔比星對(duì)自噬的影響及自噬在多柔比星心肌毒性中的作用。

1 多柔比星心臟毒性機(jī)制

多柔比星在臨床上廣泛用于肺癌、乳腺癌、實(shí)體瘤和白血病等多種惡性腫瘤化療。心臟毒性是其主要副作用之一［1-2］。成人臨床應(yīng)用的回顧性分析顯示，多柔比星累積給藥劑量為400 mg·m-2時(shí)，充血性心力衰竭的發(fā)生率為3%～5%，700 mg·m-2時(shí)提高至18%～48%。不僅如此，多柔比星所致的心臟毒性作用存在預(yù)后差和致死的嚴(yán)重后果，比例高達(dá)61%［3］。

通常認(rèn)為多柔比星的心臟毒性機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：①多柔比星在體內(nèi)代謝過程中生成大量的ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），包括·OH，O2?，H2O2和ONOO-等，而心肌細(xì)胞的過氧化物酶活性偏低，從而顯示明顯的心臟毒性［4］。②多柔比星引起心磷脂過氧化，呼吸鏈解偶聯(lián)，引發(fā)心肌線粒體代謝失常，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5］。③多柔比星可使細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比值下降，隨之線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c釋放，致使細(xì)胞凋亡［6］。④在心肌細(xì)胞中高表達(dá)的拓?fù)洚悩?gòu)酶2和多柔比星以及DNA形成復(fù)合體，引起雙鏈斷裂，導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡［7-9］。⑤多柔比星誘導(dǎo)體內(nèi)一氧化氮合酶表達(dá)，一氧化氮濃度的升高使心肌的功能酶（如肌原纖維肌酐激酶等）硝化失活，使心肌受損［10］。⑥在病理狀態(tài)下，自噬既可能對(duì)一些心肌病變具有一定的保護(hù)作用，也可能使一些心肌損傷更加惡化［2］。

2 自噬概述

自噬是細(xì)胞自身將一些蛋白質(zhì)和細(xì)胞器包裹在特定膜的結(jié)構(gòu)中，然后送入溶酶體（或液泡）降解的過程，在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為雙層膜結(jié)構(gòu)將待降解蛋白復(fù)合物、受損傷細(xì)胞器及入侵的病原體等包裹、運(yùn)送到溶酶體，被溶酶體酸性水解酶降解消化，維持著細(xì)胞的自我穩(wěn)態(tài)［11-12］。自噬按形成方式通常分為3種，即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬的特征是有獨(dú)特的雙層膜結(jié)構(gòu)——自噬體形成，自噬體包被胞質(zhì)成分，如蛋白質(zhì)聚集體，損傷或衰老的線粒體和過氧化物酶體等，最終與溶酶體融合。微自噬則是溶酶體內(nèi)陷，包裹部分胞質(zhì)進(jìn)入溶酶體，無獨(dú)立的雙層膜自噬體形成。而分子伴侶介導(dǎo)的自噬則是由特定蛋白HSC70等介導(dǎo)，具有選擇性［13］。另外，根據(jù)自噬的選擇性，又可以分為線粒體自噬和過氧化物酶體自噬等。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，自噬是細(xì)胞的一種防御和調(diào)控機(jī)制，細(xì)胞在應(yīng)答環(huán)境脅迫壓力下，會(huì)引起自噬上調(diào)，通過自噬泡包裹和消化，降解成核苷、氨基酸和脂肪酸等小分子重新循環(huán)利用，合成新的大分子和ATP，從而維持細(xì)胞的正常代謝和生存［2］。

3 自噬在多柔比星所致心臟毒性中的作用

3.1 線粒體自噬在多柔比星所致心肌毒性中的作用

多柔比星暴露可導(dǎo)致心肌細(xì)胞中ROS大量生成、線粒體受損及凋亡蛋白的表達(dá)釋放。心肌細(xì)胞中，線粒體不僅提供ATP，而且存儲(chǔ)ROS，當(dāng)線粒體受到損傷，線粒體中的ROS將釋放到胞漿中，損傷細(xì)胞核或各細(xì)胞器，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激。因此，及時(shí)清除受損線粒體能使心肌細(xì)胞內(nèi)ROS減少，增加心肌細(xì)胞的抗氧化能力。氧化應(yīng)激的增加進(jìn)一步加重了心肌細(xì)胞中DNA損傷和線粒體功能障礙，致使ROS生成進(jìn)一步增加［1］。因此，在心肌細(xì)胞中，清除受損線粒體的線粒體自噬尤顯重要。心肌細(xì)胞中的線粒體自噬主要有2條通路，即PINK1/Parkin通路和Bnip3/Nix通路。

PINK1在線粒體自噬中發(fā)揮重要功能。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)線粒體功能缺失或線粒體膜發(fā)生改變時(shí)，線粒體膜表面將聚集大量的PINK1，PINK1通過產(chǎn)生磷酸化的泛素直接激活線粒體自噬，或激活E3樣泛素連接酶Parkin，進(jìn)而使線粒體膜表面蛋白被自噬雙層膜結(jié)構(gòu)識(shí)別，包裹形成自噬小體，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生［14-15］。更有研究顯示，在多柔比星心臟毒性中，Parkin和PINK1表達(dá)水平可作為線粒體自噬水平的指標(biāo)［16］。在該研究中，給予小鼠多柔比星5 d后，PINK1或Parkin表達(dá)水平顯著降低，提示Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬水平的降低。多柔比星暴露2周后，PINK1/Parkin蛋白表達(dá)恢復(fù)至初始甚至更高的水平。另有研究表明，具有抑制線粒體分裂和線粒體自噬的多肽mdivi-1可以有效緩解多柔比星引起的心肌損傷，說明過度的線粒體自噬會(huì)加重多柔比星的心臟毒性［17］。

BNIP3和Nix均為哺乳動(dòng)物線粒體自噬受體，不需要經(jīng)過線粒體表面的泛素化修飾，可以通過其微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）相互作用模體（LC3 interacting region，LIR）結(jié)構(gòu)與微管LC3相互作用而誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。研究表明，多柔比星誘導(dǎo)的線粒體呼吸鏈損傷及細(xì)胞死亡與BNIP3基因的激活密切相關(guān)。鞣花酸可通過抑制BNIP3活性減輕多柔比星所致的線粒體損傷和心肌細(xì)胞壞死［18-19］。

3.2 自噬在多柔比星所致心臟毒性中的調(diào)節(jié)機(jī)制

自噬在多柔比星心臟毒性中的作用機(jī)制尚不完全明確，通常認(rèn)為多柔比星可以通過干擾上游通路如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）等來調(diào)控自噬，但多柔比星激活還是抑制自噬有一定分歧。研究認(rèn)為，多柔比星對(duì)機(jī)體自噬水平的影響（激活或抑制）與多柔比星的劑量和暴露時(shí)間相關(guān)，與動(dòng)物模型或研究對(duì)象的性別、年齡甚至?xí)円构?jié)律都存在一定的聯(lián)系。有研究表明，在多柔比星暴露前，自噬水平的升高有助于緩解多柔比星所致心臟毒性；而在多柔比星暴露后，抑制自噬的啟動(dòng)或自噬小體形成則具備心肌損傷保護(hù)功能［5］。

AMPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高度保守的蛋白質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量下降時(shí)，肝激酶B1（liver kinase B1,LKB 1)可磷酸化激活A(yù)MPK，活化的AMPK則可以通過抑制mTOR誘導(dǎo)自噬，進(jìn)而增加Unc-51樣激酶（Unc-51 like kinase，ULK1）磷酸化和活化ULK1。Kawaguchi等［20］證實(shí)，在多柔比星所致急性心肌損傷小鼠模型中，多柔比星引起AMPK的失活，ULK1去磷酸化，進(jìn)而降低自噬水平。而小鼠在給予多柔比星前禁食，可以提高其體內(nèi)的自噬水平，進(jìn)而有效拮抗多柔比星所致的心臟毒性。

認(rèn)為多柔比星增加自噬作用的研究表明，多柔比星可通過多種機(jī)制激活自噬。大量研究表明，多柔比星可以抑制模型動(dòng)物體內(nèi)的mTOR，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，而多柔比星對(duì)mTOR的抑制與P53的上調(diào)相關(guān)［21-22］。Chen等［23］報(bào)道了另一條與P53抑制GATA-4相關(guān)的多柔比星激活自噬通路。通常Bcl-2和Beclin1結(jié)合，阻止Beclin1和VPS34作用而引發(fā)自噬。多柔比星可以通過P53通路，抑制轉(zhuǎn)錄因子GATA-4，使Bcl-2下調(diào)，而GATA-4和Bcl-2的下調(diào)則激活自噬。另有研究認(rèn)為，多柔比星可能因?yàn)橐餉tg5和Atg12等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，進(jìn)而激活自噬［24］。白藜蘆醇則通過抑制S6K1拮抗多柔比星引起的自噬激活，從而增加心肌細(xì)胞存活率［24］。利用多柔比星大鼠心臟毒性模型，研究人員發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hy-droxy kinase，PI3K）參與了巨自噬的啟動(dòng)和成核過程。應(yīng)用3-Methyladenine抑制PI3K，可以抑制自噬體的形成，改善多柔比星導(dǎo)致的大鼠心臟功能下降［25］。

多柔比星激活還是抑制自噬以及自噬對(duì)心臟功能的影響均存在一定的分歧。有研究者認(rèn)為，多柔比星不僅影響自噬體起始和發(fā)展階段的分子通路，同樣影響溶酶體融合和功能的分子通路。研究發(fā)現(xiàn)，從H9C2細(xì)胞內(nèi)p62水平的增加可以反映出多柔比星引起了巨自噬的下調(diào)，但p62水平的增加并未伴隨LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的變化。說明多柔比星不僅影響了自噬通路的上游過程，也影響溶酶體的自噬流，而后者可能在多柔比星所致的心肌功能異常中具有更加重要的功能［26］。

4 結(jié)語

細(xì)胞自噬和凋亡通過Beclin1、Atg5和線粒體信號(hào)通路等緊密聯(lián)系，如Atg5和Atg12可以直接抑制Bcl-2家族，調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c從線粒體的釋放，從而可激活胱天蛋白酶9，導(dǎo)致凋亡。也有研究認(rèn)為，自噬體可以為凋亡蛋白（如胱天蛋白酶8等）提供活化的平臺(tái)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。事實(shí)上，細(xì)胞自噬和凋亡之間的關(guān)系較為復(fù)雜，并不像多數(shù)研究描述的那樣：自噬紊亂引起了細(xì)胞的凋亡，而簡(jiǎn)單拮抗這種自噬的失衡就可以有效的提高細(xì)胞存活率［27］。

自噬在生命體內(nèi)存在雙重作用。正常生理?xiàng)l件下，自噬引起的細(xì)胞死亡被證實(shí)是人類心衰的主要原因［2］。多柔比星如何干擾心肌細(xì)胞自噬，以及多柔比星心肌自噬與線粒體及細(xì)胞核毒性之間的關(guān)系尚未完全清楚。同樣，對(duì)增加或抑制自噬是否是多柔比星心臟毒性的主要原因還存有巨大爭(zhēng)議。深入了解多柔比星心臟毒性中的自噬過程，有助于預(yù)防和治療多柔比星導(dǎo)致心肌病變的發(fā)生。

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