趙妍 于陽 寇育榮,

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科；2.口腔生物學(xué)教研室，沈陽?110002

牙齦卟啉單胞菌調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究進(jìn)展

趙妍1于陽2寇育榮1,2

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科；2.口腔生物學(xué)教研室，沈陽?110002

細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)一種保守的降解代謝途徑，是宿主防御細(xì)菌感染的關(guān)鍵步驟。牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）作為一種牙周致病菌，能夠利用其引發(fā)的細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖，從而逃避宿主的免疫監(jiān)視。本文就P. gingivalis內(nèi)化并調(diào)控各種宿主細(xì)胞發(fā)生自噬的分子機(jī)制作一綜述，從而深入探討P. gingivalis的致病作用，并拓展P. gingivalis與全身疾病關(guān)系的研究思路。

牙齦卟啉單胞菌； 細(xì)胞自噬； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 牙齦上皮細(xì)胞

細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)一種保守的降解代謝途徑，是宿主防御細(xì)菌感染的關(guān)鍵步驟。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是目前公認(rèn)的牙周致病菌之一。該菌具有很強(qiáng)的細(xì)胞侵入能力，能夠內(nèi)化于牙齦上皮細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等宿主細(xì)胞[1-6]。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的微生物可以利用各種各樣的策略實(shí)現(xiàn)其在胞內(nèi)的滯留并維持細(xì)胞生存狀態(tài)，從而逃避宿主的免疫應(yīng)答。近年來的研究[7]表明，P. gingivalis可影響細(xì)胞自噬途徑從而實(shí)現(xiàn)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期存活。本文將著重探討P. gingivalis的內(nèi)化過程及其所誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，從而進(jìn)一步深化P. gingivalis的致病機(jī)制。

1 P. gingivalis內(nèi)化于宿主細(xì)胞

1.1 P. gingivalis的黏附與內(nèi)化

眾所周知，病原微生物和宿主細(xì)胞之間的相互作用導(dǎo)致了感染性疾病的發(fā)生。目前多認(rèn)為，P.gingivalis的菌毛通過與整合素蛋白α5β1相結(jié)合實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞的黏附，是P. gingivalis內(nèi)化于宿主細(xì)胞的初始步驟[8]。然后P. gingivalis通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞，即由細(xì)胞表面伸出偽足將細(xì)菌捕獲入胞，這一由胞外到胞內(nèi)的穿膜過程借助脂筏實(shí)現(xiàn)[7,9]。P. gingivalis與整合素相結(jié)合引起整合素相關(guān)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在亞細(xì)胞水平活化和定位，焦點(diǎn)黏附蛋白和焦點(diǎn)黏附激酶磷酸化并從胞漿聚集到胞膜周圍，形成焦點(diǎn)黏附復(fù)合體，使肌動(dòng)蛋白絲在牙齦上皮細(xì)胞表面核化形成釘狀突起。焦點(diǎn)黏附復(fù)合體的形成破壞了肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的動(dòng)力學(xué)平衡，促進(jìn)了特異靶向性胞內(nèi)信號(hào)的傳遞，最終導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排和P. gingivalis的內(nèi)化[10-11]。

P. gingivalis的黏附能力與P. gingivalis的菌株及其毒力有關(guān)[12-13]，菌株W83和381對(duì)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出相同的黏附力，并且比菌株A7436和ATCC33277的黏附力更強(qiáng)。另一方面，P. gingivalis牙齦素基因失活可使其對(duì)牙齦上皮細(xì)胞的黏附能力有所下降，因此P. gingivalis牙齦素在該菌的黏附與內(nèi)化過程中也起到重要作用[14]。

1.2 內(nèi)化的P. gingivalis的胞內(nèi)運(yùn)輸途徑

胞內(nèi)微生物的致病過程一般分為4個(gè)步驟：進(jìn)入、存活、繁殖和逃逸[15]。P. gingivalis在感染細(xì)胞內(nèi)如何轉(zhuǎn)運(yùn)尚不完全清楚。P. gingivalis內(nèi)化于宿主細(xì)胞后，可能存在3種運(yùn)輸途徑。一是進(jìn)入初級(jí)內(nèi)體（early?endosome）中，此后直接運(yùn)輸至溶酶體而降解；二是從初級(jí)內(nèi)體進(jìn)入自噬途徑；另外還有一些P. gingivalis可逃出內(nèi)體經(jīng)再循環(huán)途徑而出胞[3]，通過肌動(dòng)蛋白微絲形成的膜突實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞間的傳播，或進(jìn)入更深層的宿主組織，達(dá)到持續(xù)感染的目的[1,16]。

2 細(xì)胞自噬

自噬是細(xì)胞自身降解陳舊蛋白、細(xì)胞器，回收利用氨基酸、核酸等小分子以實(shí)現(xiàn)自身代謝需要和某些細(xì)胞器更新的過程，對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)及維持穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用[17]。在營(yíng)養(yǎng)缺乏、低氧、DNA損傷、電離輻射、病原體侵入等特殊環(huán)境下[18-19]，自噬可以通過與凋亡不同的降解機(jī)制（膜包被降解）和分子機(jī)制（特定基因的激活），使細(xì)胞程序性死亡。同時(shí)，自噬也參與了人體許多疾病的發(fā)生，如癌癥、肌功能損傷、神經(jīng)性疾病和病原體感染等[20]。自噬是一把“雙刃劍”，既能參與宿主抵御病原菌感染的過程，使侵入細(xì)胞的細(xì)菌通過脂筏介導(dǎo)的胞吞作用被運(yùn)送至溶酶體而降解[21]；也可以成為某些病原菌逃避免疫監(jiān)視的獨(dú)特策略，促進(jìn)入胞細(xì)菌的存活、增殖及感染的遷延[3]。

細(xì)胞內(nèi)的自噬過程分為以下幾個(gè)階段。1）首先在自噬的啟動(dòng)階段，在ULK1（Unc-51-like?kinase）蛋白酶復(fù)合體、PI3K（phosphatidylinositol?3-kinase）復(fù)合體Beclin-1-Vps34等分子的共同作用下，細(xì)胞胞漿中會(huì)出現(xiàn)大量游離的膜性結(jié)構(gòu)，即自噬前體（preautophagosome）。該膜性結(jié)構(gòu)目前多認(rèn)為來源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)陷，也可能源于高爾基體或線粒體膜等。2）前自噬體在由自噬相關(guān)基因（autophagy?associated?gene，ATG）5與ATG12形成的泛素樣共軛體和由微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated?protein?1?light?chain?3，LC3）與脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺（lipid?phosphatidylethano-lamine，PE）形成的泛素樣共軛體的參與下逐漸延伸，形成雙層膜性結(jié)構(gòu)空泡，即自噬體（autophagosome），并吞入部分胞漿、變性壞死的細(xì)胞器以及侵入胞內(nèi)的病原體，此為自噬體成熟階段[22]。3）隨后自噬體外膜與溶酶體膜融合，自噬體內(nèi)膜及其內(nèi)部包裹的物質(zhì)進(jìn)入溶酶體腔，形成自噬溶酶體（autolysosome）。4）最后吞噬物被溶酶體酸性水解酶消化分解，自噬溶酶體隨后進(jìn)入自身代謝循環(huán)[23]。

3 P. gingivalis誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是P. gingivalis細(xì)菌表面的重要毒力因子之一。LPS的脂質(zhì)A成分能夠被人類多種細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pattern?recognition?receptors，PRRs），如Toll樣受體（Tolllike?receptors，TLRs）所識(shí)別，二者的相互作用引起宿主細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。除了激活炎癥反應(yīng)外，宿主也可以上調(diào)胞內(nèi)降解途徑，如自噬來達(dá)到清除病原菌的目的。同時(shí)，一些內(nèi)化于胞內(nèi)的細(xì)菌在自噬途徑中可抑制自噬體的成熟或延緩自噬體與溶酶體的融合，使細(xì)菌在胞內(nèi)得以生存和增殖。胞內(nèi)P. gingivalis的定位可能因宿主細(xì)胞類型不同而異，P. gingivalis可位于不同的細(xì)胞器，如細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)體和自噬體中[24]。利用宿主自噬途徑逃避固有免疫是P. gingivalis在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的一種獨(dú)特策略，而P. gingivalis在自噬途徑中的運(yùn)輸因宿主細(xì)胞類型而異。

3.1 口腔來源細(xì)胞

3.1.1 牙齦上皮細(xì)胞 P. gingivalis作為牙周致病菌紅色復(fù)合體中的重要成員，能內(nèi)化進(jìn)入牙齦上皮細(xì)胞并引起牙齦炎癥的現(xiàn)象已基本闡明，但該菌在胞內(nèi)的生存策略尚不清楚。研究[23]表明，自噬抑制劑渥曼青霉素能顯著減少牙齦上皮細(xì)胞中P. gingivalis的數(shù)目，表明自噬可能有助于胞內(nèi)P. gingivalis的存活。Takeuchi等[23]觀察到，內(nèi)化于牙齦上皮細(xì)胞中的P. gingivalis進(jìn)入初級(jí)內(nèi)體中，約50%的細(xì)菌隨后進(jìn)入含細(xì)胞溶解酶的細(xì)胞器中，如自噬溶酶體或溶酶體。同時(shí)，胞內(nèi)其他的P. gingivalis進(jìn)入Rab11（Rasrelated?protein?in?brain?11）和RalA（Ras-related?protein?Ral-A）陽性的循環(huán)內(nèi)體而出胞，傳遞至相鄰的健康細(xì)胞，造成感染的散播和持續(xù)存在。這些結(jié)果表明，P. gingivalis在牙齦上皮細(xì)胞中可能存在3種運(yùn)輸途徑，即自噬、溶酶體及再循環(huán)途徑。吞噬細(xì)胞中溶酶體的成熟需要自噬蛋白LC3與黑素曲菌素（melanoregulin，MREG）相結(jié)合，因而MREG介導(dǎo)的LC3依賴性的降解途徑是清除細(xì)菌的必要過程，F(xiàn)rost等[25]在P. gingivalis感染的巨噬細(xì)胞中觀察到了二者的結(jié)合。Blasi等[26]在重度牙周炎患者的牙齦上皮細(xì)胞中觀察到自噬蛋白LC3與MREG的重新分布，二者呈現(xiàn)一定程度的共定位，而在輕度牙周炎及健康人群中分離的牙齦上皮細(xì)胞中則觀察不到這一現(xiàn)象。定量分析顯示健康人牙齦上皮細(xì)胞中的LC3Ⅱ水平高于牙周炎患者，同時(shí)牙周炎患者的MREG與Beclin水平降低至基線水平的50%，因而推測(cè)牙周炎患者牙齦上皮細(xì)胞中的P. gingivalis感染可能影響了MREG和（或）LC3的表達(dá)，抑制了正常的自噬過程，導(dǎo)致P. gingivalis在胞內(nèi)的清除減少從而引起慢性牙周炎的產(chǎn)生。

3.1.2 牙齦成纖維細(xì)胞 P. gingivalis引起的牙齦成纖維細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)在牙周炎結(jié)締組織喪失中起著重要的作用。以P. gingivalis外膜的LPS刺激牙齦成纖維細(xì)胞，ATG12和LC3的mRNA水平顯著升高，ATG12的蛋白水平及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變也顯著提高，表明P. gingivalis外膜LPS可以促進(jìn)自噬體的形成。自噬本身是一種通過清除損傷細(xì)胞器實(shí)現(xiàn)自我更新的過程，因而自噬可能有助于清除受損的線粒體。線粒體是所有真核細(xì)胞代謝能源的主要來源，對(duì)于細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)的維持有著重要的作用，線粒體損傷將導(dǎo)致線粒體源活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）的產(chǎn)生增多。電子顯微鏡下可以觀察到經(jīng)P. gingivalis外膜LPS處理的牙齦成纖維細(xì)胞中的自噬體能吞入部分線粒體引起線粒體的降解。同時(shí)，免疫熒光檢測(cè)也觀察到自噬蛋白LC3與線粒體標(biāo)記物細(xì)胞色素C共定位。加入抗氧化劑后，線粒體ROS和胞內(nèi)自噬泡有所減少。因此，P. gingivalis外膜LPS引發(fā)的細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)可能誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的產(chǎn)生[2,27]。此外，由自噬抑制劑處理后，P.gingivalis外膜LPS處理過的牙齦成纖維細(xì)胞中自噬泡形成減少，并伴細(xì)胞活性顯著降低和細(xì)胞凋亡率的升高，表明LPS引起的自噬對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

3.2 全身其他來源細(xì)胞

3.2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞 流行病學(xué)證據(jù)表明牙周疾病與心血管疾病之間有著潛在的聯(lián)系。在動(dòng)脈瘤、血栓及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的標(biāo)本中能檢測(cè)出P. gingivalis的DNA或直接分離出活菌；因此P. gingivalis能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，并且可以增加心肌梗死后心臟破裂發(fā)生的概率[28]。實(shí)驗(yàn)研究[1]證明，P. gingivalis能夠侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)滯留、逃避宿主清除并傳播感染。內(nèi)化的P. gingivalis可以激活胞漿型的自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅰ向膜型的LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，并增加Beclin-1的表達(dá)及ATG5與ATG12的結(jié)合，繼而激活細(xì)胞自噬。侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞的P. gingivalis在感染25～35?min時(shí)位于含Rab5的初級(jí)內(nèi)體中，30～90?min時(shí)進(jìn)入早期自噬體中[29]。隨后，大多數(shù)內(nèi)化的P. gingivalis進(jìn)入含有溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosomeassociated?membrane?protein，LAMP）1的晚期自噬體中，僅少量細(xì)菌與自噬溶酶體的組織蛋白酶共定位。其可能的原因正是P. gingivalis利用了細(xì)胞自噬機(jī)制，通過延緩自噬體與溶酶體的融合或改變正常的自噬轉(zhuǎn)運(yùn)過程而阻止自噬體向自噬溶酶體的成熟，分解利用自噬體所包裹的蛋白質(zhì)而定植在晚期自噬體內(nèi)，進(jìn)而逃脫被溶解的結(jié)局而逃出細(xì)胞外[3,8,30]。Rodrigues等[12]對(duì)比了P. gingivalis的W83、A7436、381、ATCC?33277這4種菌株在人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附、內(nèi)化和生存的能力，結(jié)果顯示不同菌株在人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸途徑及致病機(jī)制各不相同。僅W83和381菌株在胞內(nèi)被運(yùn)至自噬體，其中W83是唯一有賴于自噬在胞內(nèi)得以生存的菌株。而菌株ATCC?33277大多數(shù)由內(nèi)體運(yùn)到溶酶體而降解，菌株A7436則進(jìn)入胞內(nèi)再循環(huán)途徑。

3.2.2 肝細(xì)胞 近年來有研究表明，P. gingivalis的感染可以加速非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic?fatty?liver?disease，NAFLD）的發(fā)展。Zaitsu等[4]發(fā)現(xiàn)內(nèi)化進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)的P. gingivalis主要定位于LAMP2陽性的溶酶體中，部分與自噬蛋白LC3共定位。脂滴的存在能夠促進(jìn)感染早期（0～6?h）P. gingivalis在人肝癌細(xì)胞模型中的存活。此外，使用共聚焦顯微鏡可以觀察到脂滴能夠使感染細(xì)胞內(nèi)的自噬體的形成有所減少。因而脂滴的累積可以通過抑制溶酶體及自噬溶酶體的形成而延緩肝脂肪變性的肝癌細(xì)胞中的P. gingivalis清除，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)持續(xù)的炎癥及細(xì)胞損傷，成為NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中的危險(xiǎn)因素之一。

3.2.3 巨噬細(xì)胞 Park等[5]用P. gingivalis感染巨噬細(xì)胞初步闡明了P. gingivalis與自噬及炎癥三者相聯(lián)系的機(jī)制。加熱滅活的P. gingivalis仍能引起LC3-Ⅱ水平的增加，因而致炎因子LPS可能是介導(dǎo)P. gingivalis引起宿主細(xì)胞自噬的成分。P. gingivalis進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，炎癥小體NLRP3（NLR?family?pyrin?domain?containing?3）與AIM2（absent?in?melanoma?2）識(shí)別P. gingivalis在宿主細(xì)胞中的產(chǎn)物而激活半胱天冬酶1，從而使重要的促炎癥因子白細(xì)胞介素（interleu-kin，IL）-1家族中的 IL-1β和IL-18成熟并釋放。P.gingivalis在巨噬細(xì)胞中引起的自噬卻能夠通過胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶抑制胞內(nèi)過多IL-1β的產(chǎn)生，同時(shí)，自噬可以降解一部分的病原菌，形成dsDNA產(chǎn)物，炎癥小體AIM2可識(shí)別這種產(chǎn)物引起炎癥反應(yīng)[31]。自噬與炎癥就是這樣相互影響的兩個(gè)過程，參與慢性炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展。

3.2.4 樹突狀細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞（dendritic?cells，DCs）是機(jī)體功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，因而對(duì)胞內(nèi)病原菌的轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。DCs表面的PRRs包括TLRs和C型凝集素受體，P. gingivalis對(duì)PRRs的初始識(shí)別決定了P. gingivalis在DCs中不同的運(yùn)輸途徑[32]。DCs可以利用自噬和溶酶體途徑來清除胞內(nèi)P. gingivalis。DCSIGN（DC-specific?intercellular?adhesion?molecule-3?grabbing?non-integrin）是C型凝集素受體的一種，El-Awady等[33]觀察到，只表達(dá)短菌毛蛋白（minor?fimbrial?protein，Mfa）1的P. gingivalis靶定DC-SIGN進(jìn)入DCs后存在于單層囊泡中，并使LC3-Ⅱ、LAMP1減少，逃避自噬及溶酶體途徑，有利于P. gingivalis在胞內(nèi)持續(xù)存活。TLR2的激活卻能抑制這種作用，因此同時(shí)表達(dá)主菌毛蛋白FimA與短菌毛蛋白Mfa1的P. gingivalis381可激活TLR2，使P. gingivalis被吞入富Rab5的膜泡中而進(jìn)入初級(jí)內(nèi)體，并上調(diào)LC3-Ⅱ、LAMP1水平，形成自噬特有的胞內(nèi)雙層膜性結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞自噬和細(xì)菌死亡。P. gingivalis具有在不同環(huán)境中調(diào)節(jié)菌毛表達(dá)的能力[6]，有助于通過調(diào)節(jié)與DC-SIGN的結(jié)合而影響其在慢性炎癥中的致病性。

4 總結(jié)

目前，P. gingivalis與細(xì)胞自噬間關(guān)系的研究多集中于血管內(nèi)皮細(xì)胞，揭示了P. gingivalis誘導(dǎo)自噬與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病的聯(lián)系，P. gingivalis誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞以及其他宿主細(xì)胞發(fā)生自噬的研究也正方興未艾。P. gingivalis可能通過自噬途徑逃避宿主免疫，以獲在胞內(nèi)的持續(xù)存活并增殖，而其中的具體分子機(jī)制尚不明晰。因此通過調(diào)節(jié)自噬作為牙周病的新療法正逐步成為研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞自噬在P. gingivalis致病過程中作用的研究不斷深入，將為牙周病及相關(guān)系統(tǒng)性疾病的干預(yù)治療提供新的思路。

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Research advances on the molecular mechanism of autophagy regulated by Porphyromonas gingivalis

Zhao Yan1, Yu Yang2, Kou Yurong1,2.
(1. Dept. of Periodontics, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110002, China;2. Dept. of Oral Biology, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110002, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81300886). Correspondence: Kou Yurong, E-mail: kouyurong2005@aliyun.com.

Autophagy?is?an?intracellular?conservative?degradation?pathway.?This?event?has?been?considered?as?a?key?step?in?host?defense?against?bacterial?infection.?However,?Porphyromonas gingivalis,?as?one?of?the?evidence-sufficient?periodontal?pathogens,?can?utilize?self-induced?autophagy?to?achieve?persistent?intracellular?survival?and?proliferation,?which?enable?this?organism?to?escape?from?host?immune?surveillance.?This?review?focuses?on?molecular?mechanism?of?P. gingivalis?internalization?and?autophagy?to?illuminate?its?pathogenesis?and?to?further?explore?the?relationship?between?P. gingivalis?and?systemic?diseases.

Porphyromonas gingivalis; ?autophagy; ?vascular?endothelial?cell; ?gingival?epithelial?cell

R?781.4

A

10.7518/hxkq.2017.06.017

2017-02-14；

2017-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（81300886）

趙妍，碩士，E-mail：zzyan0802@hotmail.com

寇育榮，副教授，博士，E-mail：kouyurong2005@aliyun.com

（本文編輯 ?李彩）