吳 偉，蔡勇建，吳曉娟

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

不同貯藏期米糠制備的米糠蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性分析

吳 偉，蔡勇建，吳曉娟

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

為研究米糠酸敗對米糠蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響，以不同貯藏期米糠制備的米糠蛋白為原料，通過堿性蛋白酶水解制備米糠蛋白酶解物，研究不同貯藏期米糠制備米糠毛油和米糠蛋白氧化程度以及米糠蛋白酶解物抗氧化性。結果表明，米糠在貯藏過程中米糠脂質發(fā)生水解和氧化，米糠蛋白發(fā)生氧化，米糠蛋白二硫鍵和非二硫共價鍵參與氧化聚集體的形成。隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白水解度先增加后下降，貯藏3 d后達到最大；米糠蛋白酶解液清除2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、·、·OH能力和金屬螯合能力先增加后下降。結果顯示，米糠短期貯藏會促進米糠蛋白水解，提高酶解產(chǎn)物的抗氧化性；米糠長期貯藏抑制米糠蛋白的水解，降低酶解產(chǎn)物的抗氧化性。

米糠；米糠蛋白；蛋白質氧化；酶解產(chǎn)物；抗氧化性

我國米糠資源豐富，米糠年產(chǎn)量達1 000萬 t以上，居世界第一[1-2]；但我國米糠綜合利用水平較低，只有10%～15%的米糠用來制油或進一步綜合利用，造成我國米糠綜合利用水平低下的重要原因是我國米糠一般很難得到及時有效地穩(wěn)定化處理[3]。

米糠中含有活性很強的脂肪水解酶，極易水解脂質產(chǎn)生游離脂肪酸，導致米糠酸敗變質[4]。新鮮米糠及時有效的穩(wěn)定化處理是米糠綜合利用的前提，但我國大部分稻谷加工企業(yè)生產(chǎn)的米糠都需經(jīng)過一定時間貯藏后才能得到穩(wěn)定化米糠，因此米糠在穩(wěn)定化之前的貯藏過程中就已經(jīng)發(fā)生了不同程度的水解酸敗[5]。米糠水解酸敗過程中形成的大量游離不飽和脂肪酸極不穩(wěn)定，在米糠內(nèi)源脂肪氧合酶作用下很容易發(fā)生脂質氧化反應，使得米糠發(fā)生氧化酸敗[6]，形成的活性氧化酸敗產(chǎn)物具有共價修飾蛋白質的能力，可導致蛋白質氧化[7]。

米糠在食品工業(yè)中最重要的應用是制備米糠油，米糠制油后的脫脂米糠含15%～20%蛋白質，米糠蛋白具有過敏性低、營養(yǎng)價值高的特點，是一種極具開發(fā)潛力的新型植物蛋白[8-9]。目前關于米糠酸敗影響米糠制品品質的研究主要圍繞米糠油展開[10-12]，而忽略了米糠蛋白在米糠貯藏過程中的蛋白質氧化作用。蛋白質氧化是蛋白質分子在活性氧直接作用下，或通過次生氧化產(chǎn)物間接作用于蛋白質而導致的蛋白質共價結構修飾[13-14]。蛋白質氧化勢必影響蛋白質的水解性質，蛋白質氧化影響蛋白質水解程度以及水解產(chǎn)物性質的研究已在大豆蛋白[15-16]和肉蛋白[17-18]中報道。已有研究表明新鮮米糠在貯藏過程中米糠蛋白被氧化，并且影響米糠蛋白功能性質的發(fā)揮[19]，但目前沒有蛋白質氧化對米糠蛋白酶解物抗氧化性的研究。本實驗將新鮮米糠貯藏不同時間，穩(wěn)定化和脫脂后制備米糠蛋白，采用堿性蛋白酶酶解米糠蛋白，研究不同貯藏期米糠制備米糠蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠 湖南糧食集團有限責任公司。

2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、高硫酸鉀 美國Sigma-Aldrich公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司；鄰苯三酚（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FMHE36-24雙螺桿擠壓機 湖南富馬科食品工程技術有限公司；Sorvall LYNX 6000高速落地離心機 美國Thermo Fisher公司；722s可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠預處理

新鮮米糠過40 目篩，隨后在25 ℃、相對濕度85%條件下分別貯藏0、1、3、5、10 d，采用雙螺桿擠壓機穩(wěn)定化處理，穩(wěn)定化條件：進料量15 kg/h，水分含量16%；二區(qū)至六區(qū)溫度分別為70、120、120、70、60 ℃；隨后將穩(wěn)定化米糠與正己烷按料液比1∶4（m/V）混合脫脂，振蕩30 min后抽濾得到濾餅，收集米糠毛油，如此重復3 次；濾餅在通風櫥中風干過夜得到脫脂米糠。米糠毛油酸值測定參考GB/T 5530—2005《動植物油脂 酸值和酸度測定》，過氧化值測定參考GB/T 5538—2005《動植物油脂 過氧化值測定》。

1.3.2 米糠蛋白的制備

以脫脂米糠為原料，根據(jù)蔡勇建等[19]方法采用堿溶酸沉法制備米糠蛋白。

1.3.3 米糠蛋白羰基含量的測定

以米糠蛋白為原料，根據(jù)Wu Wei等[20]方法采用2,4-二硝基苯肼比色法測定米糠蛋白的羰基含量，以22 000 mol/（L·cm）消光系數(shù)進行計算。

1.3.4 米糠蛋白還原和非還原電泳

以米糠貯藏不同時間制備的米糠蛋白為原料，參考Wu Wei等[20]方法做還原和非還原電泳。

1.3.5 米糠蛋白水解度的測定

參考徐亞元[21]方法。稱取一定量的米糠蛋白，用蒸餾水溶解配成5 g/100 mL的溶液，調溫至40 ℃并保溫20 min，調pH值至9.0，按3 g/100 mL加入堿性蛋白酶，在40 ℃條件下用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH 9.0，酶解180 min后在85 ℃水浴鍋中滅酶10 min，水解液冷卻后在4 ℃條件下8 000 r/min離心15 min，取上清液，采用去離子水將上清液配制成0.5 mg/mL的酶解液，以0.5 mg/mL酶解液進行后續(xù)實驗。米糠蛋白水解度計算見公式（1）：

式中：V為消耗NaOH的體積/mL；Nb為NaOH的濃度/（mol/L）；α為α-氨基的解離度，1/α=1＋10pK-pH；mP為米糠蛋白的質量/g；htot為每克米糠蛋白中肽鍵的物質的量，為7.8 mmol/g。

1.3.6 米糠蛋白酶解物抗氧化能力檢測

1.3.6.1 O2－·清除能力的測定

參考徐亞元[21]方法。取1.8 mL Tris-HCl-乙二胺四乙酸緩沖液（pH 8.2，50 mmol/L）和1 mL超純水于試管中混勻，加入0.1 mL 10 mmol/L鄰苯三酚后迅速搖勻，立即測定320 nm波長處吸光度（持續(xù)測定5 min，每5 s記錄一次），求出未加酶解液鄰苯三酚自氧化速率（ΔA0）；用等體積酶解液代替超純水，求得加入酶解液后鄰苯三酚的氧化速率（ΔA1）。O2－·清除能力計算見公式（2）：

1.3.6.2 ·OH清除能力的測定

參考梅德軍等[22]方法。取0.5 mL米糠蛋白酶解液，依次加入0.5 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液、0.5 mL 1.8 mmol/L H2O2溶液，混勻后靜置10 min，再加入0.5 mL 1.8 mmol/L水楊酸溶液，混勻再靜置30 min后測定510 nm波長處的吸光度，記為Ai；用蒸餾水代替水楊酸，測定吸光度，記為Aj；以超純水代替酶解液測定吸光度，記為A0?！H清除率計算見公式（3）：

1.3.6.3 ABTS＋·清除能力的測定

參考徐亞元[21]方法。取1 mL酶解液加入4 mL ABTS＋·工作液（5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L高硫酸鉀溶液混合，避光靜置過夜）中，混勻后室溫靜置6 min，測定734 nm波長處吸光度，記為A1；用等體積無水乙醇代替酶解液，測定吸光度，記為A0。ABTS＋·清除率計算見公式（4）：

1.3.6.4 DPPH自由基清除能力的測定

參考梅德軍等[22]方法。取1 mL酶解液加入1 mL 25 μg/mL DPPH溶液中，反應30 min后測定517 nm波長處吸光度，記為Ai；取1 mL酶解液加入1 mL無水乙醇中，30 min后測定吸光度，記為Aj；取1 mL 25 μg/mL DPPH和1 mL無水乙醇混勻，30 min后測定吸光度，記為A0，以此作為空白對照。DPPH自由基清除率計算見公式（5）：

1.3.6.5 金屬螯合能力的測定

參考徐亞元[21]方法。取1 mL酶解液，加入0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液和1.85 mL超純水，混勻后加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪溶液，混勻后靜置10 min，測定562 nm波長處吸光度，記為A1，以超純水代替酶解液，測定吸光度，記為A0。金屬螯合能力計算見公式（6）：

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗平行測定3 次。數(shù)據(jù)采用軟件Microsoft Excel 2003和Origin 7.5進行處理，結果用±s表示。指標比較采用最小顯著差異法，取95%置信度（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 米糠貯藏時間對米糠毛油酸值、過氧化值和米糠蛋白羰基含量的影響

表1 米糠貯藏不同時間制備米糠毛油酸值、過氧化值和米糠蛋白羰基含量Table1 Acid values and peroxide values of crude rice bran oil and protein carbonyl contents of rice bran proteins prepared from rice bran with different storage tiimmeess

如表1所示，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠毛油酸值、過氧化值和米糠蛋白羰基含量增加，表明米糠貯藏過程中米糠脂質逐漸水解和氧化，米糠蛋白發(fā)生氧化。米糠中含有活性很強的脂肪水解酶，可將米糠中的脂質迅速水解產(chǎn)生游離脂肪酸[9]。游離不飽和脂肪酸極不穩(wěn)定，容易氧化產(chǎn)生脂質自由基和脂質活性氧化產(chǎn)物，這些脂質氧化產(chǎn)物攻擊蛋白質主肽鏈及側鏈基團，使蛋白質羰基化[19]。

2.2 米糠貯藏不同時間制備米糠蛋白電泳圖分析

圖1 米糠貯藏不同時間制備米糠蛋白電泳圖Fig.1 Electrophoresis of rice bran proteins prepared from rice bran with different storage times

米糠蛋白電泳圖如圖1所示，在還原電泳圖（圖1a）中，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白聚集體區(qū)域和高分子質量亞基條帶顏色逐漸變深，尤其是米糠貯藏5 d和10 d制備米糠蛋白聚集體區(qū)域和高分子質量亞基條帶顏色顯著加深，說明米糠較長時間貯藏導致米糠蛋白形成氧化聚集體，并且非二硫共價鍵參與了氧化聚集體的形成。Huang Youru等[23]發(fā)現(xiàn)脂肪氧合酶催化亞油酸產(chǎn)生的過氧化反應產(chǎn)物可誘使大豆蛋白氧化，形成氧化聚集體；Wu Wei等[24]發(fā)現(xiàn)脂質氧化產(chǎn)物可誘使大豆蛋白氧化形成聚集體，非二硫共價鍵參與氧化聚集體的形成。在非還原電泳圖（圖1b）中，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白聚集體區(qū)域和高分子質量亞基條帶顏色逐漸變深，尤其是米糠貯藏5 d和10 d制備米糠蛋白聚集體區(qū)域和高分子質量亞基條帶顏色顯著加深，并且非還原電泳圖中聚集體區(qū)域和高分子質量亞基條帶顏色深于對應的還原電泳圖條帶，表明二硫鍵參與米糠蛋白氧化聚集體的形成。由此表明，米糠貯藏過程中米糠蛋白氧化形成聚集體，二硫鍵和非二硫共價鍵共同參與氧化聚集體的形成。

2.3 米糠貯藏時間對米糠蛋白水解程度的影響

圖2 米糠貯藏時間對米糠蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of storage time of rice bran on the DH of rice bran proteins

如圖2所示，隨著米糠貯藏時間的延長，在相同水解時間米糠蛋白水解度先上升后下降，在米糠貯藏3 d達到最大值，表明米糠貯藏期間的蛋白質氧化影響米糠蛋白的酶水解。Zhou Feibai等[25]研究發(fā)現(xiàn)氧化亞油酸使得豬肌原纖維蛋白氧化程度增加，隨著氧化亞油酸濃度的增加，豬肌原纖維蛋白在體外模擬胃腸消化體系中的消化速率和消化程度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，并認為低濃度氧化亞油酸階段的消化速率和消化程度上升與蛋白質輕微氧化時分子結構展開有關，高濃度氧化亞油酸階段的消化速率和消化程度下降則是由于劇烈的蛋白質氧化形成了共價交聯(lián)聚集體。Davies[26]和Liu Gang[27]等也認為蛋白質的適度氧化可促進蛋白質的酶水解，過度氧化則會引起蛋白質交聯(lián)或集合形成聚集體，限制蛋白質酶解。Chen Nannan[16]用丙二醛代表脂質活性次生氧化產(chǎn)物氧化大豆分離蛋白，采用電泳研究氧化大豆蛋白體外消化性質，結果發(fā)現(xiàn)氧化大豆蛋白形成的非二硫鍵共價聚集體抑制了氧化蛋白的酶水解。由此可見，米糠短期貯藏使得米糠蛋白酶水解程度增大可能是由于低氧化程度的結構修飾使得米糠蛋白結構逐漸展開，暴露出較多易于被堿性蛋白酶識別和酶解的接觸位點造成的。隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白氧化程度顯著增加，此時米糠蛋白通過共價交聯(lián)等方式形成氧化聚集體，使得米糠蛋白與堿性蛋白質的識別和接觸位點數(shù)量下降，從而在一定程度上抑制了酶水解反應的發(fā)生。

2.4 米糠貯藏不同時間制備米糠蛋白酶解物抗氧化性分析

表2 米糠貯藏時間對米糠蛋白酶解物清除·、·OH、AABBTTSS＋·、DPPH自由基能力和金屬螯合能力的影響Table2 Effect of storage time of rice bran on free radical scavenging capacity and metal chelating capacity of rice bran protein hydrolysates

表2 米糠貯藏時間對米糠蛋白酶解物清除·、·OH、AABBTTSS＋·、DPPH自由基能力和金屬螯合能力的影響Table2 Effect of storage time of rice bran on free radical scavenging capacity and metal chelating capacity of rice bran protein hydrolysates

貯藏時間/d O2－·清除率/% ·OH清除率/% ABTS＋·清除率/% DPPH自由基清除率/%金屬螯合率/% 026.30±0.29c59.65±0.48bc55.21±0.42b53.50±0.46c45.11±0.44b129.50±0.32b61.25±0.52a58.20±0.63a55.90±0.57b48.54±0.48a330.30±0.33a61.90±0.61a59.30±0.58a58.55±0.63a48.50±0.52a524.60±0.31d60.18±0.59ab48.40±0.46c55.16±0.56b41.37±0.47c1010.10±0.11e56.40±0.59d36.40±0.20d47.90±0.54d34.85±0.45d

如表2所示，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白酶解物清除O2－·、·OH、ABTS＋·、DPPH自由基能力和金屬螯合能力先上升后下降，都在米糠貯藏3 d達到最大值，表明米糠貯藏期間的蛋白質氧化影響米糠蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性。Zhou Feibai等[25]研究發(fā)現(xiàn)隨著氧化亞油酸濃度的增加，豬肌原纖維蛋白在模擬胃腸消化體系中水解物的氧自由基吸收能力呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，并認為水解物氧自由基吸收能力上升與蛋白質輕微氧化使得蛋白質半胱氨酸和酪氨酸含量上升有關，水解物氧自由基吸收能力下降則是由于劇烈的蛋白質氧化使得抗氧化性能好的氨基酸殘基含量下降有關。You Lijun等[28]研究表明富含色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸和苯丙氨酸殘基的肽抗氧化效果顯著，并且這類抗氧化性能好的氨基酸殘基很容易在氧化應激環(huán)境下被氧化修飾。Chen Nannan等[15]采用過氧自由基代表脂質自由基氧化大豆分離蛋白，研究氧化大豆蛋白體外消化產(chǎn)物抗氧化時發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白體外消化產(chǎn)物氧自由基吸收能力和清除DPPH自由基能力隨著蛋白質氧化程度的增加而逐漸下降，并認為氧化大豆蛋白體外消化程度的降低（肽分子質量的增加）和抗氧化性能好的氨基酸殘基的氧化修飾是造成氧化大豆蛋白體外消化產(chǎn)物氧自由基吸收能力下降的原因。堿性蛋白酶酶解豬血漿蛋白[29]和富硒糙米蛋白[30]制備抗氧化肽的研究均發(fā)現(xiàn)，酶解物的抗氧化性與蛋白質的水解程度相關，蛋白質水解程度越高，酶解物抗氧化性越強。由此可見，米糠短期貯藏使得米糠蛋白酶解物抗氧化增強可能是由于低氧化程度的結構修飾使得米糠蛋白抗氧化性能好的氨基酸殘基含量上升，米糠蛋白水解程度降低和抗氧化性能好的氨基酸殘基氧化破壞，這些是米糠長期貯藏降低米糠蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的原因。

3 結3 論

將新鮮米糠在25 ℃、相對濕度85%環(huán)境下貯藏0、1、3、5、10 d后進行穩(wěn)定化和脫脂處理，制備米糠蛋白后采用堿性蛋白酶水解，研究米糠貯藏時間對米糠蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。結果發(fā)現(xiàn)：隨著米糠貯藏時間的延長，米糠毛油酸值和過氧化值增加，表明米糠貯藏期間米糠脂質發(fā)生了水解和氧化，米糠蛋白羰基含量也隨著貯藏時間延長而增加，表明貯藏期間米糠蛋白發(fā)生了氧化，蛋白質氧化導致米糠蛋白形成氧化聚集體；隨著米糠蛋白氧化程度的加深，米糠蛋白的水解度，以及米糠蛋白酶解液的ABTS＋·、DPPH自由基、·、·OH清除能力和金屬螯合能力均先增加后下降。米糠貯藏期間米糠蛋白抗氧化活性肽成分的純化、鑒定及其變化規(guī)律有待進一步研究。

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Antioxidant Activity of Enzymatic Hydrolysates of Rice Bran Proteins Prepared from Rice Bran with Different Storage Times

WU Wei, CAI Yongjian, WU Xiaojuan
(National Engineering Laboratory for Rice and By-product Deep Processing, School of Food Science and Engineering, Center South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

In order to explore the effect of rice bran rancidity on the antioxidant activity of enzymatic hydrolysates of rice bran proteins (RBP), the oxidation degrees of crude rice bran oil (RBO) and RBP prepared from rice bran samples with different storage times were investigated as well as the antioxidant activity of alcalase hydrolysates of RBP. The results indicated that storage of rice bran could lead to hydrolysis and oxidation of RBO as well as oxidation of RBP, and the disulfide and non-disulfide covalent bonds participated in the formation of oxidation aggregates of RBP. As storage time of rice bran increased, the degree of hydrolysis (DH) of RBP firstly increased until reaching the maximum value on the third day of storage and then decreased. The free radical scavenging capacity against 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radicals (ABTS+?), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals, superoxide (O2-?), radicals hydroxyl (?OH), as well as metal-chelating capacity of RBP hydrolysates showed the same trend. These results indicated that short-term storage of rice bran resulted in increased DH of RBP and antioxidant activity of their hydrolysates, whereas long-term storage reduced the DH of RBP and the antioxidant activity of their hydrolysates.

rice bran; rice bran protein; protein oxidation; hydrolysates; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201703037

TS210.9

A

1002-6630（2017）03-0227-05

吳偉, 蔡勇建, 吳曉娟. 不同貯藏期米糠制備的米糠蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 227-231. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703037. http：//www.spkx.net.cn

WU Wei, CAI Yongjian, WU Xiaojuan. Antioxidant activity of enzymatic hydrolysates of rice bran proteins prepared from rice bran with different storage times[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 227-231. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201703037. http：//www.spkx.net.cn

2016-04-11

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201319）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303071）

吳偉（1981—），男，副教授，博士，研究方向為糧油加工。E-mail：foodwuwei@126.com