張世麗 祖勉 冀飛 蔣晴晴 邱士偉 李雅蘭 郭維維 楊仕明 喬月華,3

1徐州醫(yī)科大學(xué)聽力中心（徐州221004）2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科；聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100853）3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床聽力中心（徐州221004）

哺乳動物的耳蝸能夠編碼不同頻率、不同強(qiáng)度的聲音信號，這一過程是由兩種不同類型的機(jī)械感覺細(xì)胞：內(nèi)毛細(xì)胞（Inner Hair Cell,IHC）和外毛細(xì)胞(Outer Hair Cell,OHC)參與實(shí)現(xiàn)的[1]。外毛細(xì)胞具有電能動性，對聲音信號有放大作用，使耳蝸對不同頻率的聲音具有高度的敏感性和選擇性[2]。而內(nèi)毛細(xì)胞是真正的感覺細(xì)胞，與I型傳入神經(jīng)的樹突形成突觸；傳入到內(nèi)耳的聲音信號是通過對內(nèi)毛細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械刺激，引起其釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而造成傳入神經(jīng)元興奮而引發(fā)動作電位，而將興奮傳入中樞系統(tǒng)[3]。

CSP是DnaJ/Hsp40分子伴侶家族的一員，位于神經(jīng)元突觸囊泡中，對維持神經(jīng)遞質(zhì)釋放和防止神經(jīng)退行性病變具有非常重要的作用[4,5]。CSP有α，β，γ三個亞型，已有研究報道敲除CSPα亞型對小鼠的聽力沒有影響，但是小鼠的視力卻出現(xiàn)進(jìn)行性神經(jīng)性病變，這很可能是因?yàn)樾∈蟮囊暰W(wǎng)膜細(xì)胞中只有CSPα這一個亞型的表達(dá)，而小鼠耳蝸內(nèi)同時有CSPα和CSPβ兩個亞型的表達(dá)，而且這兩個亞型發(fā)揮的功能在一定程度上存在重合，從而導(dǎo)致CSPα敲除小鼠的聽力未受到影響[6]。本實(shí)驗(yàn)通過對CSPβ在耳蝸毛細(xì)胞中的分布定位，初步分析其在生長發(fā)育過程中的表達(dá)變化，探討CSPβ與聽力之間的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

1、10、12、14、16、28和60日齡SPF級C57小鼠（軍科動物中心提供）各10只;出生1天的巴馬小香豬3只(中科院北方大動物研究基地提供)，雌雄不限。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

4%PFA,10%EDTA,兔源性抗 CSPβ抗體（1:100，proteintech,17364-1-AP）;鼠源性抗Ctbp2 抗體（1:100,美 國 BD 公 司,612044）;Alexa Flu?orence647羊抗兔（1:400,invitrigen，1834794）；phal?loidin(1:400,sigma,P-1951)；免洗 DAPI液（4',6-Di?amidino-2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚；中杉金橋）

1.2 方法

1.2.1 冰凍切片制備

耳蝸取材C57小鼠引頸脫臼處死，快速斷頭取出耳蝸，打通圓窗和卵圓窗，用游絲鑷在蝸尖打孔，4%PFA灌流，并4℃固定過夜8-12小時，將固定后的耳蝸放入10%EDTA常溫脫鈣，直至前庭部分的骨質(zhì)可用細(xì)針扎透，將脫鈣后的耳蝸依次放入15%和30%蔗糖溶液梯度脫水各3小時，將耳蝸移入裝有Tissue-Tek OCT的EP管中，浸膠2小時，然后在立體解剖顯微鏡下將耳蝸蝸軸與包埋盒底部水平位的平行線平行包埋，-20℃冷凍30分鐘后進(jìn)行切片，切片厚度為10μm。

1.2.2 耳蝸基底膜制備

耳蝸組織取材、灌流固定、脫鈣同以上冰凍切片制備方法，7天日齡以前的小鼠耳蝸組織無需脫鈣。脫鈣后的耳蝸組織置于0.1M的PBS緩沖液中，于立體解剖顯微鏡下用游絲鑷從頂回向底回剝除蝸殼，去除蝸軸，切除螺旋韌帶，撕掉前庭膜和蓋膜。

1.2.3 免疫熒光染色

將制備好的冰凍切片和基底膜用0.25%的Tri?tonX-100室溫孵育30min，PBS漂洗3次，每次10min；然后用10%山羊血清室溫封閉30min；加一抗 ，兔 源 性 抗 CSPβ抗 體（1:100，proteintech,17364-1-AP），鼠源性抗 Ctbp2抗體（1：100，BD,612044）4℃孵育過夜；PBS漂洗4次，每次15min;加二抗，冰凍切片加Alexa Fluorence647羊抗兔（1:400,invitrigen，1834794）和 phalloidin(1:400,sigma,P-1951)；基底膜加Alexa Fluorence647羊抗兔（1:400,invitrigen，1834794）；37℃孵育 1h;PBS漂洗 4次，每次15min;DAPI標(biāo)記，在冰凍切片和鋪了基底膜的載玻片上滴加一滴免洗DAPI液，蓋玻片封片。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡成像

應(yīng)用正置共聚焦顯微鏡（Zeiss780,德國）對免疫熒光染色標(biāo)本進(jìn)行觀察，選擇647nm、568nm以及358nm波長的激發(fā)光，對標(biāo)本進(jìn)行從上到下的掃描后進(jìn)行疊加形成最終的結(jié)果圖片,并對各標(biāo)本進(jìn)行熒光強(qiáng)度(熒光灰度值)的測定。

1.2.5 ABR檢測

本實(shí)驗(yàn)室采用美國TDT（型號MCO-18A20）測聽設(shè)備，Biosig32軟件系統(tǒng)對小鼠進(jìn)行ABR閾值檢測。測聽在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，測聽前使用1%戊巴比妥鈉（0.1ml/10g，腹腔注射）對小鼠進(jìn)行麻醉,麻醉滿意后插入電極，直到檢測不出波形，再增加5dB?SPL，測出可重復(fù)的波形，標(biāo)記為聽閾值(dBSPL)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CSPβ在成年C57小鼠內(nèi)耳中的表達(dá)分布

CSPβ在Corti’s器的內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，圍繞細(xì)胞核充滿整個胞質(zhì)（圖1A和B白色箭頭所示），在Corti’s器的基膜以及內(nèi)毛細(xì)胞基底部內(nèi)側(cè)的內(nèi)螺旋束神經(jīng)纖維（圖1B實(shí)線框內(nèi)所示）和外毛細(xì)胞基底部下方的傳入神經(jīng)纖維中表達(dá)。另外，CSPβ在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞質(zhì)中也有表達(dá)（如圖1C），而外毛細(xì)胞、螺旋韌帶、血管紋以及其他耳蝸結(jié)構(gòu)上未見有CSPβ的表達(dá)。

2.2 CSPβ在不同日齡的C57小鼠毛細(xì)胞中的表達(dá)

出生后1至10d，內(nèi)外毛細(xì)胞上均未見CSPβ的表達(dá)信號（如圖2所示）。直到出生后第12d，內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)才出現(xiàn)較弱的CSPβ表達(dá)信號，外毛細(xì)胞中未見CSPβ信號出現(xiàn)。出生后14至28d，CSPβ仍舊只在內(nèi)毛細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)信號隨著日齡的增加逐漸增強(qiáng)，外毛細(xì)胞上始終未見CSPβ信號表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)測得的內(nèi)毛細(xì)胞中CSPβ的熒光值（Gray）分別是：14d組小鼠為42.76±12.22,16d組小鼠為90.37±8.57,21d組小鼠為126.75±31.6,28d組小鼠為143.31±37.65。組間差異分析顯示，各組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。說明在C57小鼠的發(fā)育過程中，隨著日齡的增加，內(nèi)毛細(xì)胞中CSPβ的表達(dá)量增加（如圖4所示）。

2.3.1 CSPβ和Ctbp2共定位表達(dá)于基底膜內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)中如圖3A所示，CSPβ在內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，內(nèi)毛細(xì)胞中的Ctbp2分布表達(dá)于CSPβ的表達(dá)區(qū)域。

2.3.2 CSPβ在新生巴馬小香豬內(nèi)耳中的表達(dá)

與C57小鼠不同，剛出生的小型豬（P1）耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)中即都有CSPβ的表達(dá)(如圖中白色箭頭所示)，同時內(nèi)毛細(xì)胞下方的內(nèi)螺旋束神經(jīng)纖維也有CSPβ的表達(dá)（如圖中黃色箭頭所示）；外毛細(xì)胞及外毛細(xì)胞下傳入神經(jīng)纖維中未見CSPβ的表達(dá)。

2.4 C57小鼠發(fā)育過程中的聽力變化

在本研究的Click閾值（dBSPL）檢測中，14d組小鼠為73.5±8.84,16d組小鼠為53.50±4.74,21d組小鼠為41.00±9.06,28d組小鼠為32.00±4.83。組間差異分析顯示，各組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。說明在C57小鼠的發(fā)育過程中，隨著日齡的增加，C57小鼠的ABR(Click)閾值不斷降低（如圖4所示）。

圖1 CSPβ在60天C57小鼠內(nèi)耳中的表達(dá)。CSPβ被標(biāo)記顯示為紅色熒光信號，用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，染成藍(lán)色(A,B,C)，phalloidin標(biāo)記毛細(xì)胞的纖毛，顯示為綠色(A,B)，NF200標(biāo)記螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，顯示為綠色(C).CSPβ主要在C57小鼠的內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)（白色箭頭所示），另外，在基膜上也可見CSPβ熒光信號（黃色箭頭所示）；在內(nèi)毛細(xì)胞底部的內(nèi)螺旋束神經(jīng)纖維中（實(shí)線框內(nèi)所示）以及外毛細(xì)胞下的傳入神經(jīng)纖維中也有CSPβ表達(dá)（虛線框內(nèi)所示）。在外毛細(xì)胞、螺旋韌帶和血管紋以及前庭膜中未見CSPβ表達(dá)。Fig.1 The expression of CSPβin the inner ear of 60-day-old C57 mice.Expression of CSPβchannels(A,B,C)can be seen in red.The nuclei are stained with DAPI in blue(A,B,C).The cilia of hair cells are labeled with phalloidin in green(A,B)and the SGCs are marked with NF200 in green(C).Note CSPβare mainly expressed in cytoplasm of IHCs and SGCs of C57 adult mice(white arrow in A,B),and partly in the basement membrane(yellow arrow in A,B),the inner helix bundle of nerve fibers at the bottom of IHCs(shown within solid line box)and the afferent nerve fibers at the bottom of OHCs(shown within dotted line box).No CSPβ was expressed in the OHCs,spiral ligament and vascular lines and vestibular membrane.

圖2 不同時間點(diǎn)CSPβ在內(nèi)耳毛細(xì)胞中的表達(dá)出生后1至10d，內(nèi)外毛細(xì)胞上均未見CSPβ表達(dá)，直到出生后第12天才在內(nèi)毛細(xì)胞中出現(xiàn)CSPβ表達(dá)，但表達(dá)信號較弱，外毛細(xì)胞中未見CSPβ的表達(dá)；出生后14至28d，CSPβ仍舊只在內(nèi)毛細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)信號隨著日齡的增加逐漸增強(qiáng)，外毛細(xì)胞上始終未見CSPβ信號表達(dá)。Fig.2 The expression of CSPβduring different period in C57mice cochlear hair cells.There was no visible expression of CSPβ in hair cells between postnatal day 1 and 10.The weak expression level of CSPβwas found in the IHCs at the 12th day after birth,with no CSPβ expression in the OHCs.From 14 to 28 day after birth,CSPβ was still expressed only in IHCs,with the gradually increased signal during development.The expression of CSPβwas never seen in the OHCs.

圖3 A:CSPβ和Ctbp2共定位表達(dá)于基底膜內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)中如圖所示，CSPβ在內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，內(nèi)毛細(xì)胞中的Ct?bp2分布表達(dá)于CSPβ的表達(dá)區(qū)域。Fig.3A:CSPβ and Ctbp2 co-localized in cytoplasm of the IHCs.As shown in the figure3A,CSPβwas expressed in the cytoplasm of the IHCs,while the Ctbp2 distributed in the region of CSPβexpressed.圖3 B：CSPβ在新生豬耳蝸內(nèi)的表達(dá)新出生的小型豬耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)中都有CSPβ的表達(dá)(如圖中白色箭頭所示)，同時內(nèi)毛細(xì)胞下方的耳蝸神經(jīng)纖維也有CSPβ的表達(dá)（如圖中黃色箭頭所示）；外毛細(xì)胞及外毛細(xì)胞下傳入神經(jīng)纖維中未見CSPβ的表達(dá)。Fig.3B:The expression of CSPβ in the cochlea of new born miniature pigs.Both IHCs and SGCs of the new born miniature pigs expressed CSPβ(as shown in figure in white arrows);meanwhile the cochlear nerve fibers at the bottom of in hair cells also expressed CSPβ(as shown in figure in theyellow arrow);The expression of CSP beta was not seen in the fibers at the bottom of OHCs and the OHCs.

圖4 CSPβ在不同發(fā)育期小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞中的表達(dá)以及相應(yīng)CLICK誘發(fā)ABR閾值測定。隨著小鼠日齡的增長，C57小鼠內(nèi)毛細(xì)胞中CSPβ的熒光灰度值逐漸增加，ABR(CLICK)閾值逐漸降低。Fig.4 The fluorescence value of CSPβ and the CLICK threshold of C57 mice by postnatal day 14,16,21 and 28 respectively.As the continuous development of mouse cochlea,the fluorescence intensity of CSPβ in the IHCs gradually increased,corresponding to the gradually reduced threshold of the CLICKABR.

3 討論

已有研究表明，CSP是重要的突觸囊泡蛋白和分泌顆粒蛋白，是器官組織生長發(fā)育的必須蛋白質(zhì)，而且在神經(jīng)遞質(zhì)釋放的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4,7]。哺乳動物有三個CSP編碼基因，分別編碼CSPα，β，γ三個亞型，比較CSPα和CSPβ的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩者具有高度的同源性，然而CSPγ與其他兩個亞型差異較大[8]，雖然CSPβ的生物學(xué)功能尚不清楚，但它與CSPα具有高度的相似性（65%相同的氨基酸），因此猜測兩者具有相似的生物學(xué)功能[9]。之前就有研究者發(fā)現(xiàn)，在小鼠耳蝸的內(nèi)毛細(xì)胞中有大量CSPα的表達(dá)，但對CSPα敲除小鼠進(jìn)行聽力學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)這些小鼠沒有表現(xiàn)出任何聽力和內(nèi)耳形態(tài)學(xué)的改變，推測可能是CSPβ彌補(bǔ)了CSPα缺失帶來的功能缺陷[6]。然而，該研究的報道者并沒有對CSPβ進(jìn)行更詳細(xì)的進(jìn)一步研究，關(guān)于CSPβ在內(nèi)耳的表達(dá)情況以及功能也沒有提出具體的研究論據(jù)。另有更早的研究發(fā)現(xiàn)，CSP在出生12天的大鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靠近蝸軸的質(zhì)膜側(cè)出現(xiàn)，而在出生12天之前的大鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞內(nèi)沒有CSP的表達(dá)[10]。但此研究的研究者并未具體說明該CSP是哪一個亞型。

本研究使用CSPβ特異性抗體，利用免疫熒光染色定位的方法，揭示了CSPβ在小鼠耳蝸內(nèi)的表達(dá)情況，探索其與聽力之間的可能關(guān)系。本研究結(jié)果顯示CSPβ在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)和基底膜內(nèi)毛細(xì)胞的胞質(zhì)中大量表達(dá)，而在外毛細(xì)胞中沒有表達(dá)（圖1、圖2所示），這或許能夠說明內(nèi)毛細(xì)胞與外毛細(xì)胞進(jìn)行信息傳遞的機(jī)制有所不同。內(nèi)毛細(xì)胞主要受I型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)出的傳入神經(jīng)纖維支配，將聲信號轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動，最后傳遞給大腦，外毛細(xì)胞主要受II型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)出的傳入神經(jīng)纖維支配，它的主要功能是增加基底膜的振動幅度，增大內(nèi)毛細(xì)胞的興奮性，達(dá)到增加聽神經(jīng)興奮性的作用[11]。內(nèi)毛細(xì)胞的基底端與傳入神經(jīng)元的樹突形成獨(dú)特的帶狀突觸（Ribbon Synapse，RS），該結(jié)構(gòu)圍繞以致密神經(jīng)遞質(zhì)囊泡，是內(nèi)毛細(xì)胞特有的與神經(jīng)遞質(zhì)緊張性釋放有關(guān)的結(jié)構(gòu)[12,13]。本研究中，我們通過免疫熒光雙標(biāo)染色的方法，將突觸帶的特異結(jié)構(gòu)蛋白（C-terminal bind protein，Ctbp2）和CSPβ在基底膜上進(jìn)行共染色定位。結(jié)果顯示Ct?bp2與CSPβ共定位于內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)和基底側(cè)膜。CSPβ作為突觸囊泡蛋白CSP的一個亞型[14]，在內(nèi)毛細(xì)胞中高表達(dá)預(yù)示其可能與內(nèi)毛細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)釋放和信息傳遞有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，C57小鼠在出生后12天之前無論是內(nèi)毛細(xì)胞還是外毛細(xì)胞均未見CSPβ表達(dá)，但有研究報道，C57小鼠在出生時內(nèi)、外毛細(xì)胞上即可觀察到標(biāo)記的帶狀突觸，且剛出生時GluR2/R3 AMPA受體即已存在[15]，但此時的小鼠并沒有聽力，表明出生時突觸連接結(jié)構(gòu)即已成功建立，然而該連接在功能上尚不成熟，不具信息傳遞功能。隨著小鼠的生長發(fā)育，在出生后12天，小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞中出現(xiàn)CSPβ表達(dá)信號，與此同時（出生后第11至12天），可首次記錄到耳蝸CAP[16]。有研究報道小鼠在P14耳蝸各回發(fā)育成熟，血管紋發(fā)育成熟，也有研究報道稱C57小鼠聽覺發(fā)生的平均時間是13.2天[17，18]，這些都與CSPβ在內(nèi)毛細(xì)胞中首次出現(xiàn)的時間基本一致。隨后對出生后14天，21天，28天的C57小鼠進(jìn)行基底膜免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毛細(xì)胞中CSPβ表達(dá)信號逐漸增強(qiáng)(圖2和4所示)，同時ABR結(jié)果顯示小鼠聽力也漸趨成熟穩(wěn)定（圖4所示），這表明CSPβ的表達(dá)可能與內(nèi)毛細(xì)胞的發(fā)育成熟、帶狀突觸的功能成熟以及聽力的形成具有一定的關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究還對出生后1天的新生巴馬小香豬耳蝸基底膜進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)與C57BL/6小鼠不同的是，剛出生的小型豬耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞就有CSPβ的表達(dá)（圖3所示），有研究者對小型豬進(jìn)行內(nèi)耳形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)豬出生時耳蝸就已發(fā)育成熟，而嚙齒類動物在出生后耳蝸進(jìn)一步分化成熟[19]；而已有聽力學(xué)研究顯示豬出生后即有聽力[20]，CSPβ在小鼠與豬耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞首次出現(xiàn)的時間差異進(jìn)一步證明了豬與小鼠耳蝸發(fā)育的不同，同時CSPβ出現(xiàn)時間與聽力形成時間之間的平行關(guān)系，進(jìn)一步表明CSPβ的表達(dá)與聽力的早期形成具有密切的關(guān)系。

研究認(rèn)為，CSPα與syntaxin-1,VAMP2,,SNAP25以及電壓依賴性Ca2+通道之間存在相互作用，CSPα作為分子伴侶協(xié)調(diào)連接蛋白之間的相互作用，最終達(dá)到調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的目的[7,21]。內(nèi)毛細(xì)胞突觸結(jié)合蛋白復(fù)合體中主要包含的蛋白質(zhì)有syntaxin-1,VAMP1,,SNAP25和 L 型 Ca2+通道[22]，CSPα在內(nèi)毛細(xì)胞突觸中與這些蛋白之間的相互作用以及對遞質(zhì)釋放活動的影響尚待進(jìn)一步研究，而與CSPα具有高度同源性的CSPβ與這些蛋白之間是否存在相互作用也還需要進(jìn)行詳細(xì)研究。綜上所述，雖然目前我們的研究尚不能詳細(xì)闡明CSPβ在內(nèi)耳中的具體功能和作用機(jī)制，但根據(jù)前人的研究[6,14]和本研究中發(fā)現(xiàn)的CSPβ主要在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞中表達(dá)而不在外毛細(xì)胞中表達(dá)而且CSPβ的表達(dá)與聽力平行出現(xiàn)的規(guī)律，推測該蛋白與內(nèi)毛細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)和聽力的發(fā)育成熟之間可能存在密切聯(lián)系,可能是神經(jīng)遞質(zhì)釋放，信息傳遞以及聽覺發(fā)生的前提條件之一。

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