姜龍,宋悅凡,羅宣,武龍,叢海花,汪秋寬

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯的純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)研究

姜龍,宋悅凡,羅宣,武龍,叢?；?汪秋寬

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

為研究樹皮藻Ecklonia maxima巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成及其化學(xué)結(jié)構(gòu),以產(chǎn)自南非的樹皮藻為原料測(cè)定其基本成分,采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子層析柱對(duì)樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯粗品進(jìn)行分離純化,通過柱前衍生高效液相色譜法、紅外光譜法和核磁共振波譜法測(cè)定單糖組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:樹皮藻干基中基本營養(yǎng)成分分別為灰分18.59%、蛋白質(zhì)9.16%、脂肪0.74%;對(duì)樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯粗品進(jìn)行純化得到4個(gè)組分,分別命名為SPF1、SPF2、SPF3、SPF4,收集凍干各組分,檢測(cè)各組分得率分別為18.19%、24.02%、5.61%、4.23%,硫酸根含量分別為12.07%、5.44%、15.58%、19.30%; 4個(gè)組分主要由巖藻糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成,還含有少量的葡萄糖和木糖,其中SPF3、SPF4主要由巖藻糖和半乳糖組成,巖藻糖含量分別為70.92%和86.20%,4個(gè)組分的紅外光譜顯示出典型的多糖吸收峰,SPF1、SPF2在13C核磁共振譜177×10-6附近均出現(xiàn)糖醛酸C6信號(hào)峰,SPF3、SPF4 在18×10-6附近均出現(xiàn)信號(hào)峰,為α-L-吡喃巖藻糖C6信號(hào)峰。

樹皮藻;巖藻聚糖硫酸酯;單糖組成;結(jié)構(gòu)分析

巖藻聚糖硫酸酯 (fucoidan)是存在于褐藻細(xì)胞間及海參等棘皮動(dòng)物體壁中的大分子硫酸化多糖,其基本結(jié)構(gòu)由L-巖藻糖和硫酸基團(tuán)組成,還含有半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖和糖醛酸等,這導(dǎo)致其化學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜[1]。有研究表明,巖藻聚糖硫酸酯具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗炎[4]、降血脂[5]等多種生物活性。提取自不同種類褐藻的巖藻聚糖硫酸酯在結(jié)構(gòu)組成、生物活性方面存在較大差異,有報(bào)道表明,其生物活性與其純度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、巖藻糖含量、硫酸根含量及取代位置有一定關(guān)聯(lián)性[6]。曲桂艷[7]研究表明,源自泡葉藻的巖藻聚糖硫酸酯純化組分相對(duì)于粗提物顯示出了更高的對(duì)胰島素受體信號(hào)因子PTP1B抑制活性,且隨著巖藻糖含量的增大活性顯著升高。王景峰[8]研究表明,萱藻巖藻多糖在高劑量下各組分均具有抗凝血活性,且硫酸根含量高的組分效果更好。因此,對(duì)不同種類褐藻的巖藻聚糖硫酸酯分離純化后進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析是建立構(gòu)效關(guān)系所必需的。

樹皮藻Ecklonia maxima隸屬于褐藻門Phaeophyta、海帶目Laminariales、翅藻科Alariaceae、昆布屬Ecklonia[9],樹皮藻原生長于南非及智利海岸,中國進(jìn)口此藻種作為褐藻膠生產(chǎn)原料,其外層質(zhì)地較硬,呈灰褐色樹皮樣,在生產(chǎn)加工及活性物質(zhì)提取上存在一定困難。目前,國外關(guān)于樹皮藻的研究主要集中在其養(yǎng)殖分布、多酚提取和生物活性等方面[10],對(duì)其巖藻聚糖硫酸酯組成及結(jié)構(gòu)分析較少,國內(nèi)對(duì)樹皮藻的研究甚少。本試驗(yàn)中,以樹皮藻為原料對(duì)其巖藻聚糖硫酸酯粗品進(jìn)行分離純化,并對(duì)各分離組分的單糖組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,以期為尋找褐藻綜合加工利用的新原料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品樹皮藻干品產(chǎn)自南非海岸,樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯由國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心提供,巖藻糖、鼠李糖、木糖、半乳糖等單糖標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司,DEAE-Sepharose Fast Flow為Pharmacia進(jìn)口分裝,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器有ODK-159型全自動(dòng)凱氏定氮儀(北京盛科有限責(zé)任公司)、1260型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)、EPOCH-2型酶標(biāo)儀 (美國伯騰儀器有限公司)、ScientZ-30D型真空冷凍干燥機(jī) (寧波新芝生物科技有限公司)、Nicolet-470型紅外光譜儀 (美國Nicolet公司)。

1.2 方法

1.2.1 樹皮藻基本成分的測(cè)定 取樹皮藻干品適量,粉碎成粉末狀。使用快速水分測(cè)定儀測(cè)定樣品中水分含量,采用灼燒法、凱氏定氮法、索氏抽提法分別測(cè)定樣品中灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量。

1.2.2 巖藻聚糖硫酸酯的分離純化 稱取0.2 g樣品溶于20 mL 0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4)中,通過DEAE-Sepharose Fast Flow填裝的陰離子交換柱 (300 mm×26 mm)進(jìn)行分離純化,具體過程同文獻(xiàn)[13]。

1.2.3 單糖組成分析 分別稱取10 mg干燥恒重的巖藻糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品,溶解并定容至10 mL。稱取待測(cè)樣品20 mg溶于1.5 mL超純水中,室溫下溶解過夜,加入1.5 mL 8 mol/L三氟乙酸 (TFA)溶液,混勻,于烘箱 (105℃)中水解6 h,冷卻至室溫,以4 mol/L NaOH溶液將水解液調(diào)至中性,離心,取上清液避光保存?zhèn)溆谩?/p>

將樣品水解液單糖衍生化后,終止反應(yīng),再加入三氯甲烷,震蕩混勻,靜置后去除有機(jī)相,反復(fù)萃取多次,剩余水相通過0.45 μm水系膜進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB C-18(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫30℃,流動(dòng)相A為15%乙腈+50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),流動(dòng)相B為40%乙腈+50 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0),梯度為0 min 100%A→50 min 50%A,流速為1 mL/min,檢測(cè)波長為250 nm,進(jìn)樣體積為20 μL。

1.2.4 傅里葉紅外光譜 (FTIR)分析 稱取2 mg待測(cè)樣品,加入適量干燥溴化鉀粉末反復(fù)研磨均勻,壓制成透明均勻的薄片,掃描4000～400 cm-1范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.2.513C核磁共振波譜分析 將待測(cè)樣品在氘水中溶解過夜、凍干,再溶解于氘水中制成濃度為20 mg/mL的樣液,利用Bruker AVANCEⅢ型核磁共振分析儀在工作頻率為500 MHz、溫度為25℃條件下進(jìn)行13C核磁共振分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹皮藻基本成分

經(jīng)測(cè)定,樹皮藻樣品水分含量為11.56%± 0.06%,其他基本成分含量按干基計(jì)算,灰分含量為 18.59% ±0.07%,蛋白質(zhì)含量為 9.16% ± 0.28%,脂肪含量為0.74%±0.02%。

2.2 巖藻聚糖硫酸酯的分離純化

如圖1所示,樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯粗品經(jīng)過梯度洗脫得到4個(gè)組分,分別命名為SPF1、SPF2、SPF3、SPF4,其中SPF1為流出峰,SPF2～SPF4為鹽度梯度洗脫峰。從表1可見:各組分中總糖、硫酸根含量和純度均為SPF4最高,SPF2最低。

圖1 巖藻聚糖硫酸酯梯度洗脫曲線Fig.1 Grade elution curve of fucoidan

表1 各組分總糖及硫酸根含量Tab.1 Carbohydrate and sulphate contents of the purified fractions

2.3 單糖組成分析

樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯各純化組分的液相色譜分析結(jié)果如圖2和表2所示,通過比對(duì)圖3中各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和峰面積,確定4個(gè)組分的單糖構(gòu)成及相對(duì)含量,SPF2中含量最高的是鼠李糖,其次是木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖和巖藻糖,還含有少量的半乳糖和葡萄糖,且在甘露糖出峰位置附近出現(xiàn)兩個(gè)相鄰峰,可能是由于組分中存在甘露糖的同分異構(gòu)體或甘露糖醛酸,因此這一組分的構(gòu)成相對(duì)復(fù)雜。SPF1、SPF3和SPF4中含量最多的單糖均為巖藻糖,其中SPF4中比例最高,為86.21%, 而SPF2中僅含有15.34%的巖藻糖,4個(gè)組分間的單糖組成及含量有明顯區(qū)別。

圖2 SPF1～SPF4的高效液相色譜圖Fig.2 The HPLC of SPF1-SPF4

表2 各組分單糖含量 (單糖摩爾比)Tab.2 Content of monosaccharide in each fraction(monosaccharide mole ratio)

圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖高效液相色譜圖Fig.3 The HPLC of mixed standard monosaccharides

2.4 紅外光譜分析

從圖4可見:4個(gè)組分均顯示出典型多糖結(jié)構(gòu)吸收譜帶,在3600～3200 cm-1范圍內(nèi)均出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰 (3435、3389、3438、3467 cm-1),這是多糖結(jié)構(gòu)中共有的O-H鍵伸縮振動(dòng),且各組分在3000～2800 cm-1范圍出現(xiàn)C-H伸縮振動(dòng)吸收峰(2937、2926、2921、2944 cm-1);SPF1、SPF3、SPF4在1260～1250 cm-1內(nèi)有強(qiáng)吸收峰,為S=O伸縮振動(dòng),符合硫酸根測(cè)定結(jié)果,這3個(gè)組分中含有較多硫酸基團(tuán),SPF2在這一范圍的吸收峰較弱,這與該組分硫酸根含量 (5.44%)較低相對(duì)應(yīng);各組分在1075～1030 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰對(duì)應(yīng)的是C-O-C或C-O-H伸縮振動(dòng)。此外,SPF1和SPF2在1420～1410 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的C-H變角振動(dòng)吸收峰,在1630 cm-1附近有較強(qiáng)的C=O伸縮振動(dòng)峰,結(jié)合單糖組成分析結(jié)果,應(yīng)歸因于這兩個(gè)組分含有的葡萄糖醛酸。SPF1、SPF2分別在820、822 cm-1處有赤道配位的C-O-S伸縮振動(dòng)吸收峰,SPF3、SPF4分別在855、848 cm-1處有較強(qiáng)的軸向配位C-O-S伸縮振動(dòng)吸收峰。

2.5 核磁共振碳譜分析

從圖5可見,SPF1～SPF4在高場區(qū)18×10-6附近均出現(xiàn)信號(hào)峰,這是巖藻糖C6或鼠李糖C6的特征信號(hào)峰,SPF4在18.5×10-6處信號(hào)峰相對(duì)強(qiáng)度高于其他3個(gè)組分,這與單糖組成及紅外光譜所得的結(jié)果一致,SPF4中含有更多的巖藻糖。半乳糖C6的特征信號(hào)峰出現(xiàn)在 (62～63)×10-6之間,且各組分在 (67～83)×10-6內(nèi)均出現(xiàn)復(fù)雜信號(hào)峰, (67～76)×10-6范圍內(nèi)可能是未被取代的C2～C5信號(hào)峰,在 (76～83)×10-6內(nèi)的信號(hào)峰與C2～C5位的硫酸根取代有關(guān)。SPF1、SPF2在(177.5～178.5)×10-6范圍內(nèi)均存在一個(gè)信號(hào)峰(177.9×10-6、177.8×10-6處),但在高場區(qū)23×10-6附近未見信號(hào)峰,可以推測(cè)是葡萄糖醛酸C6的信號(hào)峰,SPF1～SPF4在101×10-6附近的信號(hào)峰對(duì)應(yīng)異頭碳C1[13]。

圖4 SPF1～SPF4紅外光譜圖Fig.4 The IR spectra of SPF1-SPF4

圖5 SPF1～SPF413C核磁共振譜圖Fig.513C NMR spectra of SPF1-SPF4

3 討論

3.1 巖藻聚糖硫酸脂的單糖組成

目前,已經(jīng)有多種褐藻中巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道,不同種類褐藻提取的巖藻聚糖硫酸酯單糖組成差異較大。徐杰等[14]發(fā)現(xiàn),羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯主要由巖藻糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖組成,經(jīng)Q-Sepharose Fast Flow純化得到3個(gè)組分F1、F2、F3,其中F3的巖藻糖含量最高,為70.5%;劉承穎等[15]利用DEAE-C52純化半葉馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯得到F1和F2兩個(gè)組分,主要由巖藻糖和糖醛酸組成;吳元峰等[16]研究了裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯,經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析純化得到5個(gè)組分F1～F5,其中F1、F4、F5主要由巖藻糖和半乳糖組成,F2、F3中含有鼠李糖、巖藻糖、甘露糖,還含有少量木糖和葡萄糖。同種褐藻以不同方法提取的巖藻聚糖硫酸酯,因其在提取過程中硫酸根的保留程度不同以及褐藻膠雜質(zhì)含量的差異等,對(duì)巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)分析也產(chǎn)生了影響。張淑平等[17]研究了乙醇沉淀法和電解質(zhì)沉淀法對(duì)所提取的海帶巖藻聚糖硫酸酯中總糖、硫酸根含量等的影響,發(fā)現(xiàn)使用乙醇沉淀法提取物中各項(xiàng)指標(biāo)均高于后者。何云海等[18]利用復(fù)合酶解法提取裙帶菜孢子葉中巖藻聚糖硫酸酯,結(jié)果表明,該方法較傳統(tǒng)水煮法所得粗提物中硫酸根含量更高。本研究中采用復(fù)合酶解-乙醇沉淀法提取樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯,利用DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析純化得到4個(gè)組分 SPF1～SPF4,鹽度梯度洗脫組分SPF2、SPF3和SPF4中巖藻糖含量逐漸升高,而SPF2中單糖組成復(fù)雜,除巖藻糖外還含有較多的鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖,這與吳元峰等[16]的研究結(jié)果相似。

3.2 巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)

關(guān)于樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)的研究較少, Zhang等[19]對(duì)樹皮藻等4種褐藻巖藻聚糖硫酸酯粗提物進(jìn)行了液相色譜分析,結(jié)果表明,樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯粗提物中有38%的巖藻糖和41%的半乳糖以及少量的葡萄糖、甘露糖和木糖,但并未對(duì)粗提物進(jìn)行純化。而本研究中,SPF2組分中檢測(cè)到了較多的鼠李糖含量,這可能是由于樹皮藻的生長環(huán)境和采摘季節(jié)不同造成的;SPF3、SPF4單糖組成中巖藻糖含量均在70%以上,但這2個(gè)組分的得率較低,分別為5.61%和4.23%。

劉舒[20]通過紅外光譜分析了3種褐藻中巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu),其中多肋藻的3個(gè)純化組分CF1～CF3分別在821、818、817 cm-1處有吸收峰,表明這3個(gè)組分的硫酸基團(tuán)連接在巖藻糖的C4位上。張文清等[21]研究發(fā)現(xiàn),海帶巖藻聚糖硫酸酯TC1在848 cm-1處有吸收峰,是連接在巖藻糖C2 或C3位上硫酸基團(tuán)的吸收峰。本研究中,通過紅外光譜分析表明,SPF1在820 cm-1的吸收峰表明硫酸基團(tuán)連接在巖藻糖的C2或C3位上,SPF2、SPF3、SPF4分別在860、855、848 cm-1的吸收峰表明其硫酸基團(tuán)主要連接在巖藻糖的C4位上。

核磁共振碳譜是解析復(fù)雜碳水化合物的有效方法,本研究中結(jié)合單糖組成分析結(jié)果,SPF1、SPF2在18×10-6附近出現(xiàn)的信號(hào)峰應(yīng)歸因于組分中的鼠李糖和巖藻糖,且SPF2在此處的信號(hào)峰主要來源于鼠李糖C6;(96～106)×10-6是多種異頭碳C1的信號(hào)區(qū)間,雷松藻巖藻聚糖硫酸酯的13C核磁分析表明,在101.3×10-6、104.3×10-6處分別是α-D-甘露糖的C1信號(hào)峰和β-D-葡萄糖醛酸的C1信號(hào)峰[22];Cong等[23]研究表明,羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)中的β-D-半乳糖的C1信號(hào)峰出現(xiàn)在103.5×10-6處,而α-D-甘露糖、β-D-葡萄糖醛酸的C1信號(hào)峰分別出現(xiàn)在 (99.9～100.3)× 10-6、 (102.7～103.0) ×10-6區(qū)間;Bilan等[24]通過二維核磁共振波譜確認(rèn)了墨角藻純化后的第4個(gè)組分 (巖藻糖含量95%以上)結(jié)構(gòu)中α-L-巖藻糖C1信號(hào)峰出現(xiàn)在 (98.0～101.2)×10-6區(qū)間?？梢?在不同研究結(jié)果中,同種異頭碳C1的出峰位置不完全相同。王展等[25]也在研究中指出,多種異頭碳會(huì)出現(xiàn)重疊或相鄰峰,且同種單糖在多糖結(jié)構(gòu)中的位置不同會(huì)造成C1化學(xué)信號(hào)的遷移。本研究中,組分SPF1和SPF2均含有較多的甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和鼠李糖,而這2個(gè)組分在(96～106)×10-6區(qū)間信號(hào)峰比較集中,沒有明顯區(qū)分開強(qiáng)度較大的信號(hào)峰,因此,難以判斷該信號(hào)區(qū)域內(nèi)相鄰近的信號(hào)峰分別對(duì)應(yīng)的單糖殘基類型, 而SPF3和SPF4中巖藻糖為主要組成單糖,僅含有少量的半乳糖,可以確定在101×10-6和18×10-6處分別為α-L-吡喃巖藻糖的C1和C6信號(hào)峰。

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Purification and chemical structure of fucoidan extracted from brown seaweed Ecklonia maxima

JIANG Long,SONG Yue-fan,LUO Xuan,WU Long,CONG Hai-hua,WANG Qiu-kuan

(College of Food Science and Engineering,National Research and Development Branch Center for Seaweed Processing,Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The basic components were determined in brown seaweed Ecklonia maxima from South Africa and then crude fucoidan was subjected to a DEAE column chromatography,with four fractions named as SPF1,SPF2, SPF3,and SPF4.It was found that the seaweed had ash content of 18.59%,protein content of 9.16%,and fat content of 0.74%on the dry basis.The four fractions were collected and freezing dried,and then the yield,carbohydrate content and sulphate content were measured.The results showed that the yield and sulphate content were shown to be 18.19%and 12.07%in SPF1,24.02%and 5.44%in SPF2,5.61%and 15.58%in SPF3,and 4.23%and 19.30%in SPF4.The monosaccharide compositions and structural features of each fraction were analyzed by HPLC,FTIR,and NMR spectroscopy.The monosaccharides SPF1-SPF4 was primarily composed of fucose,galactose,rhamnose,mannose,and glucuronic acid,with small amount of glucose and xylose,in which fucose(70.92%)and galactose(86.20%)were the main constituents in SPF3 and SPF4.The IR spectra of the four fractions showed the typical absorption bands of polysaccharides,with signal peak of glucuronic acid C6 in SPF1 and SPF2 in the vicinity of 177×10-6in13C NMR spectroscopy.The 18×10-6regions of SPF3 and SPF4 were assigned to C6 of α-L-fucopyranose.

Ecklonia maxima;fucoidan;monosaccharide composition;structure analysis

TS254.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.013

2095-1388(2017)01-0073-06

2016-12-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31471610);國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng) (201405040)

姜龍 (1990—),男,碩士研究生。E-mail:562589336@qq.com

汪秋寬 (1962—),女,教授。E-mail:wqk320@dlou.edu.cn