杜娟++羅秋水++杜華英++熊建華++王文君++吳國強(qiáng)

摘要：通過正交試驗(yàn)法對(duì)香水百合中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用分光光度法測(cè)定其提取率。以維生素C為陽性對(duì)照，分別測(cè)定其抗氧化能力、對(duì)DPPH自由基及ABTS自由基的清除能力及還原力。結(jié)果表明，香水百合的最佳提取工藝為提取溫度60 ℃、提取時(shí)間1.5 h、料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、乙醇濃度70%，在最佳提取條件下，香水百合中總黃酮的提取率可達(dá)11.23%。香水百合總黃酮具有一定的抗氧化性，其FRAP值為261.01 g/mL；在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除率有良好線性關(guān)系，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為29.54、 17.32 g/mL。在一定濃度范圍內(nèi)，香水百合的還原力呈線性增加趨勢(shì)。由結(jié)果可知，香水百合具有一定的抗氧化性，但其抗氧化能力弱于維生素C。

關(guān)鍵詞：香水百合；總黃酮；抗氧化性；清除活性

中圖分類號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0320-03

收稿日期：2015-11-04

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科技計(jì)劃（編號(hào)：GJJ13281）。

作者簡介：杜娟（1986—），女，江西南昌人，博士，講師，主要從事食品安全檢測(cè)研究。Tel：（0791）83813420；E-mail：dujuanjulia@163.com。

通信作者：吳國強(qiáng)，博士，講師，主要從事天然產(chǎn)物分離與檢測(cè)研究。Tel：（0791）83813420；E-mail：wgoing-651@163.com。

香水百合（Lilium casa blanca）是多年生鱗莖類球根草本植物，主要用于觀賞[1]。目前，對(duì)于香水百合的研究多集中于其揮發(fā)性成分[2]。黃酮類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，目前已知的黃酮類化合物單體有8 000多種。該類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化性，能清除機(jī)體代謝過程產(chǎn)生的多種自由基，且具有抗癌殺菌等功效，是一類極具開發(fā)前景的化合物[3]。目前，尚未有香水百合中總黃酮抗氧化性的研究報(bào)道。本研究利用70%甲醇溶液提取香水百合中的總黃酮，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定其抗氧化性，以期為香水百合的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮香水百合（市售）。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（西隴化工股份有限公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、甲醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等，以上試劑均為國產(chǎn)分析純；試驗(yàn)所用水為二次蒸餾水。

XY-200型粉碎機(jī)（永康市松青五金工具廠）；723型可見分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（寧波新芝生物科技股份有限公司）；水浴鍋、干燥箱、電子天平等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1香水百合總黃酮含量的測(cè)定

采用硝酸鋁顯色法對(duì)香水百合中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定[4]，準(zhǔn)確稱取205 mg干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷粉末，用70%甲醇溶解得蕓香苷儲(chǔ)備液，使用時(shí)用70%甲醇稀釋至0.205 mg/mL。準(zhǔn)確移取蕓香苷稀釋液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別放置于 50 mL 容量瓶中，加入70%甲醇溶液至總體積6.00 mL，再分別加入5%亞硝酸鈉2.00 mL，振蕩均勻，放置6 min，然后加入10%氯化鋁1.00 mL振蕩均勻，放置6 min，最后加4%氫氧化鈉 20.00 mL，搖勻，用水定容，放置15 min，在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度對(duì)蕓香苷對(duì)照品含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.010 3x+0.068，線性范圍為0～24.6 g/mL，相關(guān)系數(shù)0.995。

1.2.2香水百合總黃酮提取工藝的確定

取約0.5 g干燥至恒質(zhì)量后打碎的香水百合粉末，置于燒瓶中，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度的4個(gè)因素下，每個(gè)因素設(shè)立3個(gè)水平試驗(yàn)，設(shè)計(jì)L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化香水百合中總黃酮提取工藝，因素水平設(shè)計(jì)見表1。每1處理平行2次。

1.2.3香水百合總黃酮抗氧化能力的測(cè)定

1.2.3.1總抗氧化能力的測(cè)定

采用血漿鐵離子還原能力（FRAP）法測(cè)定香水百合總黃酮提取物的鐵離子還原能力[5]。在試管中加入 3.0 mL 新鮮配制的FRAP試劑，隨后加入0.1 mL不同濃度的提取液，混勻，在37 ℃下保持40 min，冷卻，在波長593 nm處測(cè)定紫外吸光度。采用維生素C作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，樣品的鐵離子還原能力以達(dá)到1 mmol/L硫酸亞鐵溶液同樣的吸光度時(shí)所需樣品濃度表示，即為其FRAP值。

1.2.3.2清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]的方法測(cè)定香水百合總黃酮提取物清除DPPH自由基能力。將濃度為2.0×10-4 mol/L DPPH乙醇溶液2 mL和提取液2 mL在試管中混勻，避光于25 ℃下保持30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度D517 nm。用乙醇作為空白對(duì)照。同時(shí)采用維生素C作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，DPPH自由基清除率由下式計(jì)算：

[JZ（]Sa=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。[JZ）][JY]（1）

式中：Sa表示DPPH自由基清除率（%）；Di表示2 mL DDPH溶液和2 mL樣品溶液混合后的吸光度；Dj表示2 mL樣品溶液和2 mL乙醇溶劑混合液的吸光度；D0表示2 mL DDPH溶液和2 mL乙醇溶劑混合液的吸光度。

1.2.3.3清除ABTS自由基能力的測(cè)定[7]

將2 mL不同濃度提取液加入2 mL一定濃度ABTS溶液中，反應(yīng)15 min后，于734 nm處測(cè)定其吸光度，同時(shí)采用維生素C作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，以2 mL ABTS溶液加入2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，ABTS自由基清除率K由式（2）計(jì)算：

[JZ（]K=（D0-D）/D0×100%。[JZ）][JY]（2）

式中：K表示ABTS自由基清除率（%）；D0表示2 mL ABTS溶液和2 mL蒸餾水混合后的吸光度；D表示2 mL ABTS溶液和2 mL樣品溶液混合后的吸光度。

1.2.3.4還原力的測(cè)定

參照普魯士蘭法測(cè)定香水百合總黃酮提取物的還原力[8]。在10.0 mL試管中分別加入不同濃度的提取液1.0 mL，磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值為 6.6）0.5 mL、0.3%鐵氰化鉀溶液1.5 mL，在50 ℃水浴 20 min 后快速冷卻，再加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液（TCA），混勻后以3 000 r/min離心10 min，取2.0 mL上清液，加入0.5 mL 0.3%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min后，定容至 100 mL，于700 nm下測(cè)定吸光度，以蒸餾水作參比溶液。

2結(jié)果與分析

2.1香水百合總黃酮提取工藝的測(cè)定

由表2、表3可見，影響提取率因素的主次順序?yàn)榱弦罕?gt;提取時(shí)間>提取溫度>乙醇濃度，提取溫度、提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度4個(gè)因素對(duì)得率的影響均是明顯的。由表4可知，A、B、C、D因素各水平之間差異極顯著（P<0.01），同時(shí)A、B、C、D 4個(gè)因素中，A3、B1、C1、D2水平得率最高，因此以得率為指標(biāo)，提取的最佳水平組合是A3B1C1D2，即提取溫度60 ℃，提取時(shí)間 1.5 h，料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇濃度70%。在最優(yōu)條件下平行提取2次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出平均提取率為11.23%，優(yōu)于正交試驗(yàn)中任何1組。

2.2香水百合總黃酮抗氧化活性的測(cè)定

2.2.1總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

抗氧化劑具有還原性，酸性條件下可將鐵離子還原成亞鐵離子，與TPTZ結(jié)合后表現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并在593 nm處有最大吸光度，隨抗氧化劑的濃度不同，溶液表現(xiàn)出不同的吸光度，可作為樣品中總抗氧化能力的測(cè)定指標(biāo)[9]。一般以FRAP值表示樣品的總抗氧化性，即樣品的吸光度達(dá)到1 mmol/L FeSO4·7H2O同樣吸光度時(shí)的濃度。FRAP值越小，則樣品的抗氧化性越強(qiáng)。分別測(cè)定不同濃度硫酸亞鐵溶液的吸光度，得到線性方程為y=0.737 5x+0.008 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 7；分別取不同濃度的樣[CM（25]品及維生素C與FRAP試劑反應(yīng)，得到吸光度隨濃度的關(guān)[CM）]

系（圖1）。與1 mmol/L FeSO4·7H2O的吸光度相比較，得到維生素C、樣品的FRAP值分別為81.08、261.01 g/mL。

2.2.2清除DPPH自由基能力測(cè)定結(jié)果

DPPH是種以氮為中心的單電子有機(jī)合成的自由基，后者乙醇溶液呈紫色，最大吸收波長為517 nm。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，其提供1個(gè)電子與DPPH自由基的孤電子配對(duì)，吸收消失或減弱，導(dǎo)致溶液顏色變淺，由紫色變?yōu)辄S色，在517 nm處的吸光度變小，其減小程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系[10]。因此，該法可以用來表征某種物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力，自由基清除劑的清除能力越強(qiáng)，對(duì)應(yīng)吸光度越小，一般以DPPH自由基清除率為50%的樣品濃度（IC50）來衡量樣品對(duì)DPPH自由基清除能力。

由圖2可見，維生素C在0～10 g/mL、樣品在0～52 g/mL 的濃度區(qū)間內(nèi)，自由基的清除率隨樣品的濃度呈[CM（25]線性增長的關(guān)系，維生素C、樣品的IC50分別為7.39、[CM）]

29.54 g/mL。結(jié)果表明，樣品具有一定的清除DPPH自由基的能力，但弱于維生素C。

2.2.3清除ABTS自由基測(cè)定結(jié)果

ABTS自由基水溶液呈綠色，當(dāng)ABTS溶液中加入自由基清除劑時(shí)，其孤電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，導(dǎo)致溶液顏色變淺，在734 nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系[11]。由圖3可見，維生素C在0～7 g/mL、樣品在0～22 g/mL濃度區(qū)間內(nèi)，試樣濃度與自由基清除率存在著良好的線性關(guān)系。維生素C和樣品的IC50分別為4.68、17.32 g/mL。結(jié)果表明，香水百合總黃酮提取物可以作為良好的ABTS自由基清除率，但其清除能力弱于維生素C。

[TPDJ3.tif]

2.2.4還原力測(cè)定結(jié)果

抗氧化劑具有還原性，能將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，隨后亞鐵氰化鉀與Fe3+作用，再次生成鐵氰化鉀，以700 nm波長處檢測(cè)普魯士藍(lán)的吸光度表示還原力的大小，吸光度越高，待測(cè)物的還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)[12]。由圖4可見，維生素C在0～50 g/mL、樣品在0～74 g/mL 的濃度區(qū)間內(nèi)，隨著待測(cè)物質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)體系的吸光度也線性增大，說明在所選濃度范圍內(nèi)，維生素C和[CM（25]樣品都具有一定的還原力，且維生素C的增長趨勢(shì)強(qiáng)于樣[CM）]

[TPDJ4.tif]

品，說明樣品的還原力弱于維生素C。

3結(jié)論

由正交試驗(yàn)結(jié)果分析可得，香水百合中總黃酮提取的最佳條件：提取溫度60 ℃，提取時(shí)間1.5 h，料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇濃度70%。在該條件下對(duì)香水百合中總黃酮進(jìn)行提取，提取率可達(dá)11.23%?？寡趸栽囼?yàn)結(jié)果表明，香水百合中總黃酮提取物具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力，對(duì) DPPH 自由基和ABTS自由基都有一定的清除作用，且具有一定的還原力，但其各項(xiàng)能力均弱于維生素C。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，香水百合中總黃酮的含量較高，且已表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用，有望作為一種新型的天然抗氧化劑被開發(fā)利用。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[1]朱嶠，潘遠(yuǎn)智，趙莉. 氮、磷、鉀、鈣對(duì)香水百合生長及葉片養(yǎng)分含量的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（5）：274-284.

[2]張輝秀，胡增輝，冷平生，等. 不同品種百合花揮發(fā)性成分定性與定量分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（4）：790-799.

[3]Stojanovic S，Sprinz H，Brede O. Efficiency and mechanism of the antioxidant action of trans-resveratrol and its analogues in the radical liposome oxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2001，391（1）：79-89.

[4]陳向明，徐濤，查甫本. 山核桃外果皮黃酮提取與純化[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2011，42（12）：177-181.

[5]盧靜. 林檎葉化學(xué)成分的分離及其提取物的抗菌、抗氧化活性研究[D]. 重慶：重慶大學(xué)，2014：31-33.

[6]郭雪峰，岳永德，湯鋒，等. 用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)竹葉提取物抗氧化能力[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（7）：1578-1582.

[7][JP2]劉薇，邱樂，楊婧，等. ABTS與鄰二氮菲-Fe3+法測(cè)定保健食品抗氧化能力比較分析[J]. 食品工業(yè)，2013，34（3）：120-124.

[8]羅秋水，上官新晨，蔣艷，等. 紫紅薯糖蛋白體外抗氧化活性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（4）：809-813.

[9]胡芳，趙智慧，劉孟軍. 金絲小棗類黃酮提取最佳條件及抗氧化研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2012，12（4）：77-83.

[10]李鉉軍，崔勝云. 抗壞血酸清除DPPH自由基的作用機(jī)理[J]. 食品科學(xué)，2011，32（1）：86-90.

[11]朱玉昌，焦必寧. ABTS法體外測(cè)定果蔬類總抗氧化能力的研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（8）：77-80.

[12]羅秋水，杜華英，熊建華，等. 葛根異黃酮類化合物提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2015，15（2）：104-110.