李美玲，張業(yè)玲，丁曉，雷煒，陸海軍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島 266071)

人宮頸癌Hela細(xì)胞TPX2基因沉默對放射敏感性的影響

李美玲，張業(yè)玲，丁曉，雷煒，陸海軍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島 266071)

目的 觀察TPX2基因沉默的人宮頸癌Hela細(xì)胞對X射線的敏感性。方法 將宮頸癌Hela細(xì)胞分為TPX2-siRNA組、NC-siRNA組、Control組，TPX2-siRNA組轉(zhuǎn)染TPX2-siRNA，NC-siRNA組轉(zhuǎn)染NC-siRNA即空載體siRNA，Control組僅加入轉(zhuǎn)染試劑。采用實(shí)時熒光定量PCR、Western blot分別檢測各組細(xì)胞中的TPX2 mRNA與蛋白。采用CCK8法檢測不同劑量(0、2、4、6 Gy)X線照射后TPX2-siRNA組細(xì)胞的增殖抑制率。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測4 Gy X線照射前后TPX2-siRNA組細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果 與NC-siRNA組、Control組相比，TPX2-siRNA組細(xì)胞TPX2 mRNA、蛋白相對表達(dá)量降低(P均<0.05)。TPX2-siRNA組細(xì)胞接受0、2、4、6 Gy X線照射后，細(xì)胞增殖抑制率分別為4.71%±0.15%、5.26%±0.69%、6.64%±0.13%、15.19%±0.73%，兩兩組間比較P均<0.05。TPX2-siRNA組細(xì)胞接受4 Gy X線照射前后細(xì)胞凋亡率分別為11.43%±0.03%、12.68%±0.03%，兩者比較P<0.05。結(jié)論 TPX2基因沉默的人宮頸癌Hela細(xì)胞對X射線的敏感性增加。

TPX2基因；基因沉默；宮頸癌；放射敏感性

TPX2是一種編碼基因定位于人12號染色體的微管相關(guān)蛋白，能激活細(xì)胞周期激酶Aurora A，并調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體的形成[1]。已有研究[2]發(fā)現(xiàn)，TPX2過表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)，且與染色體的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。在女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，目前放療已經(jīng)成為宮頸癌的主要治療方法之一，但放療敏感性的降低使宮頸癌的治療出現(xiàn)瓶頸。已有研究[3]發(fā)現(xiàn)，TPX2基因在宮頸癌中存在過表達(dá)，并與宮頸癌的侵襲性、分期分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。2015年1月～2016年1月，本研究應(yīng)用小干擾技術(shù)，觀察TPX2基因沉默后人宮頸癌Hela細(xì)胞的放射敏感性?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 宮頸癌Hela細(xì)胞購于青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Hyclone公司，逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR試劑盒、DNA Maker1000試劑購于美國TaKaRa公司，siRNA模板由廣州銳博生物科技公司設(shè)計合成，riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑購于廣州銳博生物科技公司，TPX2抗體購于CST公司，GAPDH抗體購于康維試劑公司，real-time PCR所需引物的設(shè)計與合成由上海生工公司完成，CCK8試劑盒購于Sigma公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購于江蘇碧云天生物試劑有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)、PCR儀(FTC-3000上海楓嶺)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 宮頸癌Hela細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度中，在含10%胎牛血清、2%雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為TPX2-siRNA組、NC-siRNA組、Control組。

1.3 TPX2基因沉默方法 根據(jù)GenBank中TPX2的基因號(NM-012112)，針對靶基因TPX2由廣州銳博生物科技公司設(shè)計siRNA，上游序列：5′-GAACUUUACAUCUGAACUA-3′，下游序列：3′-CUUGAAAUGUAGACUUGAU-5′。TPX2-siRNA組轉(zhuǎn)染TPX2-siRNA，NC-siRNA組轉(zhuǎn)染NC-siRNA即空載體siRNA，Control組僅加入轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染前將(1～5)×105個處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞均勻接種于適量完全培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)孔中，至細(xì)胞貼壁30%～50%時，用30 μL的1×riboFECTTMCP Buffer稀釋1.25 μL 20 μmol/L siRNA儲存液，加入3 μL的riboFECTTMCP Reagent，吹打搖勻后室溫孵育30 min后將riboFECTTMCP混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中混勻，將培養(yǎng)板放置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4 各組細(xì)胞TPX2 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR。收集轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞,提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄說明書制備cRNA，在FTC-3000PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。TPX2上游引物為5′-TATGCCACCTGCAAAGCAGA-3′，下游引物為5′-ACAGGTTGCCCTATTCCAGC-3′。GAPDH上游引物為5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物為5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′。反應(yīng)條件為循環(huán)40次，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。以2-ΔΔCt法計算細(xì)胞TPX2 mRNA相對表達(dá)量。

1.5 各組細(xì)胞TPX2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。收集轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白后用BCA法測定蛋白濃度。制備15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量10 μL，120 mV恒定電壓下電泳2 h后轉(zhuǎn)膜1.5 h，取出轉(zhuǎn)移膜，用50 g/L的脫脂牛奶封閉，兔抗人一抗(1∶5 000)、GAPDH一抗(1∶2 000)孵育過夜。PBST洗膜3遍，10 min/次，加入(1∶10 000)稀釋的山羊抗兔辣根酶標(biāo)記IgG(H+L)二抗，室溫孵育1 h后PBST洗膜3次，10 min/次。用ECL發(fā)光液處理膜，暗室內(nèi)曝光。TotalLab 2.0軟件分析各組蛋白條帶灰度值并計算TPX2蛋白相對表達(dá)量(目的基因條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.6 TPX2基因沉默Hela細(xì)胞的放射敏感性觀察 利用VARIAN直線加速器，采用6 MV-X線，照射的劑量率為2 Gy/min，源皮距為100 cm，照射野為10 cm×10 cm，同時在培養(yǎng)板下置1 cm等效組織填充物，并控制機(jī)架角為180°。細(xì)胞在室溫下接受照射。①CCK8法檢測Hela細(xì)胞的增殖抑制率。將TPX2-siRNA組、Control組處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞以6×103/孔分別接種于96孔中，轉(zhuǎn)染后采用不同劑量(0、2、4、6 Gy)X線照射，每組設(shè)6個復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于分光光度計450 nm波長處測量OD值。根據(jù)OD值計算各組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值)/Control組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。②細(xì)胞凋亡檢測。使用Annexin V-FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，根據(jù)其說明書進(jìn)行操作。將TPX2-siRNA組處于對數(shù)生長的細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染后以4 Gy X線照射。培養(yǎng)24 h，胰酶消化，PBS洗滌后混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，依次加入Annexin V-FICT和碘化丙啶(PI)試劑，室溫，避光15 min后，即采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。用Flow Jo分析得到的數(shù)據(jù)，計算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞TPX2 mRNA相對表達(dá)量比較 TPX2-siRNA組、NC-siRNA組、Control組TPX2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.47±0.01、0.81±0.01、1，TPX2-siRNA組與NC-siRNA組、Control組相比，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞TPX2蛋白相對表達(dá)量比較 TPX2-siRNA組、NC-siRNA組、Control組TPX2蛋白相對表達(dá)量分別為0.55±0.07、0.81±0.13、0.80±0.05，TPX2-siRNA組與NC-siRNA組、Control組相比，P均<0.05。

2.3 TPX2-siRNA組細(xì)胞對放療的敏感性 TPX2-siRNA組細(xì)胞接受0、2、4、6 Gy X線照射后，細(xì)胞增殖抑制率分別為4.71%±0.15%、5.26%±0.69%、6.64%±0.13%、15.19%±0.73%，兩兩組間比較P均<0.05。TPX2-siRNA組細(xì)胞接受4 Gy X線照射前后細(xì)胞凋亡率分別為11.43%±0.03%、12.68%±0.03%，兩者比較P<0.05。

3 討論

宮頸癌是世界范圍內(nèi)位居第三位的腫瘤，且患病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢。高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)感染已被證實(shí)是宮頸癌發(fā)生的主要病因[4]。不斷改進(jìn)的根治性子宮切除術(shù)及輔助性放化療可以提高早期宮頸癌患者的存活率，但在晚期宮頸癌療效不明顯。對于局部晚期宮頸癌，放療成為其最主要的治療手段之一，但是隨著劑量的累積，腫瘤對于放射的敏感性逐漸下降，嚴(yán)重影響了放療效果。

TPX2是一種細(xì)胞周期蛋白，在維持有絲分裂紡錘體的穩(wěn)定性中起重要作用[5]。作為一種微管相關(guān)蛋白，在有絲分裂時，TPX2與紡錘體緊密結(jié)合。研究[6]證實(shí)，TPX2在許多腫瘤如唾液腺癌、肺癌、乳腺癌存過表達(dá)，并且其異常表達(dá)與中心體的擴(kuò)增、異倍體的產(chǎn)生、腫瘤的形成與侵襲力有關(guān)。最近的研究[7]發(fā)現(xiàn)，TPX2在宮頸癌細(xì)胞中也存在過表達(dá)。此外，過表達(dá)的TPX2可阻止有絲分裂的正常進(jìn)行，同時擾亂其自身信號通路的正常傳導(dǎo)[8]。大量的實(shí)驗(yàn)表明，降低TPX2的水平可能對治療腫瘤有益。通過RNA干擾技術(shù)，下調(diào)TPX2的表達(dá)能夠使有絲分裂中微管的形成失敗，從而導(dǎo)致紡錘體無法形成。比如TPX2下調(diào)可以有效降低肝細(xì)胞癌、胰腺癌細(xì)胞的增殖和存活能力[9,10]。有研究[11]認(rèn)為過度表達(dá)的TPX2降低了電離輻射誘導(dǎo)γ-H2AX增加的作用，其中γ-H2AX可以作為衡量DNA損傷的指示器。有研究者認(rèn)為，γ-H2AX在電離輻射后存在一個形成與消失的過程，其存在的時間長短與腫瘤放療敏感性之間存在相關(guān)關(guān)系[12]。Gernot等[11]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的TPX2耗損后，應(yīng)用電離輻射可導(dǎo)致γ-H2AX的短暫增加。本研究通過RNA干擾技術(shù)對Hela細(xì)胞中TPX2基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，以觀察沉默TPX2的Hela細(xì)胞的放射敏感性。研究結(jié)果表明，沉默TPX2基因的Hela細(xì)胞在接受射線照射時，隨著劑量的增加，各組細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加。且TPX2-siRNA組接受照射后細(xì)胞凋亡率增加。這些說明了沉默TPX2基因的Hela細(xì)胞對射線的敏感性增加。

本研究存在一些缺陷，siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)揮作用存在一定的時效性，其不穩(wěn)定性決定了實(shí)驗(yàn)的局限性；并且在進(jìn)行細(xì)胞對射線的敏感性觀察中，缺少對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為改變的研究。

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陸海軍(E-mail： lhj82920608@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.015

R730.55

A

1002-266X(2017)02-0047-03

2016-09-16)