豆醬微生物宏蛋白質組提取及分析

烏日娜，薛亞婷，張 平，唐筱揚，陶冬冰，岳媛媛，張鵬飛，陳 衛(wèi)*

（1.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

豆醬微生物宏蛋白質組提取及分析

烏日娜1,2，薛亞婷1，張 平1，唐筱揚1，陶冬冰1，岳媛媛1，張鵬飛1，陳 衛(wèi)2,*

（1.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

為了更進一步探索豆醬中微生物群體的功能，實驗利用分步提取法，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，建立了豆醬微生物宏蛋白質組表達譜，并利用液相色譜-質譜/質譜聯(lián)用技術對蛋白質進行鑒定。結果顯示，共鑒定出232 種蛋白質，可歸為糖代謝60 種、核酸代謝57 種，蛋白質代謝48 種，能量代謝15 種，脂質代謝3 種，其他功能蛋白質49 種。來源于細菌的蛋白質數量幾乎為來源于真菌蛋白質數量的3 倍，其中細菌來源以枯草芽孢桿菌、明串珠菌、糞腸球菌、腸膜明串珠菌和德氏保加利亞乳桿菌為主，真菌來源以釀酒酵母、裂殖酵母、鏈孢霉、白腐菌和棉阿舒囊霉為主。

豆醬；宏蛋白質組；蛋白質功能；微生物來源

豆醬營養(yǎng)豐富、香氣馥郁，是東北很多家庭的必備食品，而且傳承著冬季做醬的傳統(tǒng)習俗。豆醬的品質和風味與其中的微生物組成密切相關，目前對豆醬中微生物研究已經由純培養(yǎng)菌種特性研究，如乳酸菌[1-3]、酵母菌[4]、霉菌[5]等，轉向利用變性梯度凝膠電泳技術、新一代測序技術等對其中微生物多樣性進行研究[6-8]，例如Nam等[9]利用454焦磷酸測序技術對韓國豆醬細菌多樣性進行了分析，提供豐富的物種組成信息。

宏蛋白質組學的概念是在宏基因組學[10-11]概念的基礎上提出的，他們有著共同的優(yōu)點：將研究對象從單一微生物拓展到復雜的微生物群落，不再依賴于微生物培養(yǎng)[12-14]，但宏基因組學存在諸多限制：如DNA提取較困難，純度要求高，克隆表達效率低，需要篩選完整的功能基因組，構建大片段的基因組文庫十分復雜[15]；重復基因和基因表達的時空特異性也為研究增加了阻礙。轉錄也面臨RNA易降解，萃取時產生的腐殖質難消除，即使相似的基因在不同群落的轉錄動力學也不同，RNA與相關蛋白質合成關聯(lián)性低等問題[16]。宏蛋白質組學的興起很大程度上彌補了這些缺陷。其對于所研究微生物群體的限制性較小，鑒定蛋白質時無需標記，可通過反向遺傳學推測氨基酸序列獲得相應的編碼基因信息，追蹤復雜環(huán)境中微生物群體的功能[17-18]，對宏基因組學起到補充作用，將宏基因組數據和自然環(huán)境的生物過程聯(lián)系在一起。宏蛋白質組學在蛋白質鑒定、種系發(fā)生以及微生物群體的功能性分析等方面都更具優(yōu)勢[19]。2004年Rodríguez-Valera[20]首次提出宏蛋白質組的概念，是指復雜環(huán)境微生物群落中所有生物的蛋白質組總和?？琢瞽偟萚21]利用該技術鑒定了黃酒麥曲浸提液中所有可溶性蛋白質，為探索微生物與黃酒風味之間的關系奠定了基礎。張武斌[22]利用宏蛋白質組學技術對清香白酒生產常用的3 種大曲進行分析，檢測到釀酒酵母合成的乙醇-O-酰基轉移酶，確認其為清香白酒酯化功能菌。豆醬中微生物宏蛋白質組還鮮有報道，它是指豆醬中所有微生物產生的全部蛋白質。豆醬微生物宏蛋白質組研究，可為發(fā)現功能蛋白質標記物、種系發(fā)生以及微生物群體的功能性分析提供依據，也為進一步揭示微生物與豆醬品質形成關系提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

采集自遼寧省沈陽市農家利用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法制備的豆醬，用保溫箱帶回實驗室，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

丙烯酸胺、Tris、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、N,N-甲叉雙丙烯酞胺、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 美國Sigma公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、溴酚藍、3-（（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基）-1-丙磺酸（3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) propanesulfonate，CHAPS） 美國Bio-Rad公司；過硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、冰乙酸、無水乙醇、丙酮、考馬斯亮藍G-250 北京鼎國生物技術有限公司。

裂解液：稱取尿素8.408 1 g，硫脲3.044 8 g，CHAPS 0.8 g，蛋白質酶抑制劑PMSF 0.003 5 g，DTT 0.2 g于20 mL容量瓶中，加入去離子水定容混勻，分裝至2 mL離心管，-20 ℃條件下保存。

1.1.3 儀器與設備

Centrifuge 5418R小型臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；脫色搖床 上海華亭科學儀器廠；細胞超聲儀 上海豫明儀器有限公司；分析天平 榮華儀器有限公司；CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)、Mini電泳系統(tǒng)、電泳儀 美國Bio-Rad公司；恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；VS-1型渦旋儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司；Cary 50紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；Q-Exactive質譜儀 美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物宏蛋白質組的提取

1）樣品初步處理：取豆醬樣品70 g放于500 mL離心桶中，加入200 mL磷酸鹽緩沖液，放入直徑1 cm的玻璃珠30 顆，渦旋儀振蕩離心桶10 min。將玻璃珠取出，2 000 r/min離心20 min，取出上清液；沉淀中加入150 mL磷酸鹽緩沖液搖勻，2 000 r/min離心20 min，取上清液；將收集的所有上清液2 000 r/min離心20 min后，收集上清液，棄去沉淀。

2）收集菌體沉淀，提取蛋白質：將所得上清液6 000 r/min離心20 min，將沉淀移至研缽中，利用液氮研磨輔助10% TCA/丙酮方法提取蛋白質，得到蛋白質粉末[23]。

3）上清液中提取蛋白質：將6 000 r/min離心后所得的上清液12 000 r/min離心20 min，收集沉淀物，用5 mL磷酸鹽緩沖液清洗后12 000 r/min離心20 min收集沉淀物并轉移至2 mL離心管，每管加入1.5 mL丙酮清洗沉淀，放入-20 ℃冰箱靜置2 h，12 000 r/min離心20 min，棄上清液，收集沉淀物，重復2 次，沉淀冰上風干得到胞外蛋白質粉末。

1.2.2 微生物宏蛋白質組的裂解

分別取適量沉淀和上清液蛋白質粉末于2 mL離心管中，按照0.1 g/mL加入裂解液，20%（26 W）功率超聲助溶20 min，工作2 s停3 s，12 000 r/min離心1 h，取上清液。

1.2.3 蛋白質定量

配制10 mg/mL BSA母液，稀釋至1 mg/mL，按照Bradford微量蛋白質測定法制作標準曲線，測定蛋白質樣品的質量濃度[20]。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測提取效果

利用SDS-PAGE對從豆醬中提取的微生物胞內和胞外宏蛋白質組進行檢測。分離膠質量濃度為12g/100mL，濃縮膠濃度為5g/100mL。電泳程序為：80 V，15 min； 120 V至電泳結束。

1.2.5 液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定宏蛋白質組

將電泳后的蛋白質泳道切下，放入1.5 mL離心管中，加入1 mL滅菌的去離子水，利用LC-MS/MS進行蛋白質鑒定（北京華大蛋白質研究公司），使用Mascot 2.3.01進行數據搜索。

2 結果與分析

2.1 微生物宏蛋白質組定量結果

豆醬中微生物胞內宏蛋白質組蛋白質量濃度為5.45 mg/mL，胞外宏蛋白質組蛋白質質量濃度為5.12 mg/mL。胞內和胞外蛋白質樣品的質量濃度均大于5 mg/mL，能夠滿足SDS-PAGE的需要。

2.2 SDS-PAGE結果

豆醬中微生物胞內和胞外宏蛋白質組的電泳結果如圖1所示，胞外蛋白質條帶集中分布在15～40 kD以及70～120 kD之間，胞內蛋白質可見11 條較清晰的蛋白質條帶，這些蛋白質的分子質量在15～160 kD之間。在15～120 kD之間有8 條顏色較深的蛋白質條帶，說明在這個分子質量區(qū)間的蛋白質數量較多，在120～160 kD之間有3 條顏色較淺的蛋白質條帶，說明在這個分子質量區(qū)間的蛋白質數量較少。

2.3 微生物宏蛋白質組LC-MS/MS鑒定結果

利用LC-MS/MS對豆醬中微生物宏蛋白質組進行檢測，搜索細菌和真菌數據庫，其中蛋白質評分在38 分以上為可信（P＜0.05）。在豆醬微生物宏蛋白質組中，共鑒定出232 種蛋白質，其中包括173 種細菌蛋白質，59 種真菌蛋白質，見表1、2。

綜合分析，在232 種蛋白質中，與糖代謝相關的蛋白質60 種，占25.9%，與核酸代謝相關的蛋白質57 種，占24.6%，與蛋白質代謝相關的蛋白質48 種，占20.7%，與能量代謝相關的蛋白質15 種，占6.5%，與脂質代謝相關蛋白質3 種，占1.3%，其他功能蛋白質49 種，占21.1%。

微生物通過糖代謝為機體供能，并繼續(xù)進行糖類的合成和分解。在微生物宏蛋白質組中，檢測到與糖代謝相關的蛋白質數量最多。而核酸與微生物生長密切相關，其數量次之。蛋白質的表達要經過起始、延伸和終止3 個步驟，每一步都需要各種蛋白質發(fā)揮作用[24]，其中，與谷氨酸代謝相關的蛋白質數量占優(yōu)勢，可能與其風味相關。

2.4 基于宏蛋白質組微生物來源分析

宏蛋白質組來源于72 種細菌，23 種真菌。其中來自枯草芽孢桿菌的蛋白質有14 種，占6.0%，來自明串珠菌的蛋白質有13 種，占5.6%，來自糞腸球菌的蛋白質有11 種，占4.7%，來自腸膜明串珠菌和德氏保加利亞乳桿菌的蛋白質有7 種，各占3.0%，來自鮑曼不動桿菌、腸桿菌和大腸桿菌的蛋白質有5 種，各占2.2%，來自大腸桿菌O157:H7、惡臭假單胞菌、化膿性鏈球菌血清型M3、解淀粉芽孢桿菌、乳酸乳球菌、嗜鹽四聯(lián)球菌、植物乳桿菌的蛋白質有3 種，各占1.3%，來自其他細菌的蛋白質有85 種，占36.6%；來自釀酒酵母的蛋白質有17 種，占7.3%，來自裂殖酵母的蛋白質有8 種，占3.4%，來自鏈孢霉的蛋白質有4 種，占1.7%，來自白腐菌和棉阿舒囊霉的蛋白質有3種，各占1.3%，來自其他真菌的蛋白質24 種，占10.3%。

豆醬微生物宏蛋白質組中，來源于細菌的蛋白質數量幾乎為來源于真菌蛋白質數量的3 倍，其中細菌來源以枯草芽孢桿菌、明串珠菌、糞腸球菌、腸膜明串珠菌和德氏保加利亞乳桿菌為主，真菌來源以釀酒酵母、裂殖酵母、鏈孢霉、白腐菌和棉阿舒囊霉為主。

目前已報道的豆醬中的優(yōu)勢細菌相關研究，包括明串珠菌、芽孢桿菌和腸桿菌等[25-28]。芽孢桿菌可協(xié)助真菌分解大豆中的蛋白質和淀粉，而明串珠菌則與豆醬中風味物質的形成相關。尤其是明串珠菌在其中占有優(yōu)勢，與本團隊利用宏基因組技術進行的分析，結果一致。之前的研究都還未明確確定明串珠菌在豆醬發(fā)酵過程中的重要地位，因此，本團隊將繼續(xù)進行相關研究。此外，棉阿舒囊霉為豆醬中新發(fā)現的優(yōu)勢菌種。

除此之外，白色念珠菌、馬鏈球菌、惡臭假單胞菌為條件致病菌，金黃色葡萄球菌為病原菌，希瓦氏菌為腐敗菌，創(chuàng)傷弧菌可造成感染，蠟狀芽孢桿菌、威氏李斯特菌血清型6b可引起食物中毒，恥垢分枝桿菌可引起皮膚和軟組織感染，這些菌種可能來自于環(huán)境，也可能是發(fā)酵時產生的，它們對食用豆醬的安全性造成了威脅，因此對有害菌種的監(jiān)控還需加強。

3 結 論

實驗利用宏蛋白質組學技術，對豆醬中微生物組成和蛋白質功能進行了分析。其中，來源于細菌的蛋白質數量幾乎為來源于真菌蛋白質數量的3 倍，說明了發(fā)酵過程中細菌逐漸取代真菌，占主導地位，而且明串珠菌可能在豆醬發(fā)酵過程中起到重要作用。從蛋白質功能角度，以糖代謝、核酸代謝和蛋白質代謝為主，其中的功能酶及與豆醬風味相關的酶類需要進一步研究。

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Metaproteomic Analysis of Traditional Fermented Soybean Paste in Northeast China

WU Rina1,2, XUE Yating1, ZHANG Ping1, TANG Xiaoyang1, TAO Dongbing1, YUE Yuanyuan1, ZHANG Pengfei1, CHEN Wei2,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to under the function of the microbial community in fermented soybean paste, we established a metaproteomic expression profile by stepwise extraction and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The proteins extracted were identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry-mass spectrometry (LC-MS/MS). Results obtained were as follows: the number of proteins identified in fermented soybean paste was 232, including 60 proteins participating in sugar metabolism, 57 proteins involved in nucleic acid metabolism, 48 proteins involved in metabolism, 15 proteins related to energy metabolism, 3 proteins related to lipid metabolism and 49 other functional proteins. The number of proteins derived from bacteria was almost three times as large as the number of proteins derived from fungi. Bacterial proteins were mainly derived from Bacillus subtilis, Leuconostoc, Fecal streptococcus, Leuconostoc mesenteroides and Deshi Lactobacillus, while fungal proteins mainly came from Saccharomyces cerevisiae, Fission yeast, Alternaria, white rot fungi and Ashbya gossypii.

fermented soybean paste; metaproteomics; protein function; microbiota

10.7506/spkx1002-6630-201714003

TS201.3

A

1002-6630（2017）14-0017-07

烏日娜, 薛亞婷, 張平, 等. 豆醬微生物宏蛋白質組提取及分析[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 17-23.

10.7506/ spkx1002-6630-201714003. http://www.spkx.net.cn WU Rina, XUE Yating, ZHANG Ping, et al. Metaproteomic analysis of traditional fermented soybean paste in northeast China[J]. Food Science, 2017, 38(14): 17-23. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714003. http://www.spkx.net.cn

2016-06-29

國家自然科學基金面上項目（31471713）；中國博士后科學基金項目（2014M560395）；遼寧省農業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目（2014048）；遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃項目（LR2015059）；江蘇省博士后科研資助計劃項目（1402071C）

烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wrn6956@163.com

*通信作者：陳衛(wèi)（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：chenwei66@jiangnan.edu.cn