葉碧霞，左勇，賴琳，陳樂春

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢 643000）

甜面醬保溫發(fā)酵過程中微生物的研究

葉碧霞，左勇＊，賴琳，陳樂春

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢 643000）

采用分離計數(shù)方法探究甜面醬保溫發(fā)酵過程中的微生物組成及變化規(guī)律，并對優(yōu)勢菌株進行初步分離與鑒定。結(jié)果表明：甜面醬保溫發(fā)酵過程中，細(xì)菌數(shù)量先上升后下降，霉菌數(shù)量則呈下降趨勢，未檢測出酵母。通過分離獲得4株優(yōu)勢霉菌和5株優(yōu)勢細(xì)菌，經(jīng)初步鑒定，其中2株為米曲霉，1株為黑曲霉，1株為根霉，2株為芽孢桿菌屬，其余3株分別為假單胞菌屬、鏈球菌屬及德克斯氏菌屬。生理效價檢測結(jié)果表明：鏈球菌屬細(xì)菌產(chǎn)酸及氨基態(tài)氮能力較強，分別為1.2%，0.43%；黑曲霉產(chǎn)糖化酶活力較高，約為352.33U／g，M2米曲霉菌株產(chǎn)蛋白酶活力較高，為53.7U／g。

甜面醬；保溫發(fā)酵；微生物；生理效價

甜面醬是以面粉或小麥為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的一種半固態(tài)調(diào)味品。其釀制過程通常包含原料蒸煮、通風(fēng)制曲、拌鹽水發(fā)酵等階段［1］。原料經(jīng)蒸煮初步糊化后，在通風(fēng)制曲階段霉菌生長繁殖并分泌大量的糖化酶、蛋白酶等，拌鹽水發(fā)酵初期主要是多種酶類降解大分子物質(zhì)為小分子的還原糖、多肽等的過程。隨著發(fā)酵進行，細(xì)菌利用小分子糖類和氨基酸等生長發(fā)酵產(chǎn)酸、氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)進一步構(gòu)成了甜面醬的風(fēng)味和營養(yǎng)成分［2，3］。整個釀制過程中，微生物發(fā)酵劑質(zhì)量優(yōu)劣直接關(guān)乎甜面醬成品的滋味、香氣以及口感等。因而，優(yōu)良的發(fā)酵菌株對于開發(fā)醬類發(fā)酵劑十分重要。

基于此，本研究以不同保溫發(fā)酵階段的甜面醬醬醪為研究對象，研究甜面醬保溫發(fā)酵過程中的微生物變化規(guī)律。通過對甜面醬保溫發(fā)酵過程中的微生物進行分離、計數(shù)，以期獲得甜面醬在保溫發(fā)酵過程中的微生物組成情況。同時，通過傳統(tǒng)分離鑒定獲得發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群，探討優(yōu)勢菌株應(yīng)用于甜面醬釀制過程的可能，旨在拓寬甜面醬釀制菌種的選擇范圍，為改善甜面醬的質(zhì)量風(fēng)味提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 面醬樣品

來源于四川省自貢市某食品廠。以拌鹽水后入室內(nèi)保溫發(fā)酵池發(fā)酵起始記為0天。保溫發(fā)酵周期通常為60天，保溫階段1周進行1次倒醅，故樣品采集時間設(shè)置為0，7，14，21，35，49，56，60天。

1.1.2 微生物平板計數(shù)與分離培養(yǎng)基

細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，霉菌采用PDA培養(yǎng)基，酵母采用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基。

1.2 主要儀器

HH－S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；AR1140電子天平 奧豪斯公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HL MJ－250恒溫恒濕箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SKY－2012C恒溫?fù)u床 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同發(fā)酵時期甜面醬中微生物的分離計數(shù)

1.3.1.1 樣品處理

無菌條件下，稱取10g甜面醬樣品于盛有90mL無菌水的250mL錐形瓶中，35℃，270r／min條件下振搖30min。

1.3.1.2 分離計數(shù)

微生物的計數(shù)：平板菌落計數(shù)法［4］。

1.3.2 優(yōu)勢菌種的鑒定

鑒定方法：微生物形態(tài)學(xué)鑒定、常規(guī)生理生化鑒定等［5－10］。

1.3.3 優(yōu)勢菌種的生理效價測定

1.3.3.1 霉菌的生理效價測定

糖化酶的測定：斐林試劑標(biāo)準(zhǔn)糖液反滴定法測定［11］；蛋白酶活力的測定：福林－酚試劑法［12］；黃曲霉素：薄層色譜層析法［13］。

1.3.3.2 細(xì)菌的生理效價測定

總酸（以乳酸計）及氨基態(tài)氮的測定：酸堿滴定法及甲醛滴定法［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜面醬保溫發(fā)酵過程中微生物的變化情況

甜面醬在保溫發(fā)酵過程中，微生物之間的相互作用，降解原料中的大分子物質(zhì)。通過分離計數(shù)，獲得甜面醬保溫發(fā)酵不同時間段的微生物組成及變化情況，見圖1。

圖1 甜面醬保溫發(fā)酵過程中微生物的變化規(guī)律Fig.1 The change rule of microorganism in sweet flour paste during the insulation fermentation

由圖1可知，甜面醬保溫發(fā)酵過程中，發(fā)酵初期，霉菌占據(jù)優(yōu)勢，隨著發(fā)酵的進行，霉菌數(shù)量開始下降，而細(xì)菌逐漸呈上升趨勢，約1周以后，細(xì)菌數(shù)量也開始下降；發(fā)酵后期，微生物數(shù)量維持在較低的水平。其原因可能是：霉菌經(jīng)通風(fēng)制曲階段大量產(chǎn)孢子得以生長繁殖，拌鹽水進入保溫發(fā)酵初期，有氧環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧狀態(tài)，加之高鹽的環(huán)境不利于霉菌的生長，所以出現(xiàn)數(shù)量的逐漸下降；細(xì)菌在保溫發(fā)酵的初期數(shù)量呈現(xiàn)上升，這與生長環(huán)境的改變相關(guān)，隨著發(fā)酵的進行，醬醪粘稠度增加，傳質(zhì)與傳氧能力減弱，同時pH逐漸降低，過酸的環(huán)境抑制微生物的生長，因而導(dǎo)致微生物數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢。整個保溫過程未檢測出酵母菌，可能由于保溫發(fā)酵是通過控制整個發(fā)酵過程較高的品溫（38～45℃）以實現(xiàn)大分子物質(zhì)的快速降解，而酵母菌通常適宜的生長溫度在28～30℃，保溫發(fā)酵環(huán)境不利于酵母菌的生長繁殖，因此通過傳統(tǒng)的分離計數(shù)未能檢測出酵母菌，這與曾燦偉［15］、沈芳等［16］的研究結(jié)果相一致。

老福無可奈何地說：“好，這次就聽您的，等您出院了吧。以后別再給我找這種事了，我不是心理醫(yī)生，沒工夫老陪他們聊天?！?/p>

2.2 甜面醬保溫發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌種的分離與鑒定

2.2.1 霉菌的分離與鑒定

由2.1試驗結(jié)果可知，霉菌主要是在制曲階段大量存在，保溫發(fā)酵的初期主要是通過其分泌的各種酶類起作用，降解原料中的大分子物質(zhì)。從不同發(fā)酵時間段的甜面醬醬醪中，分離出4株典型霉菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為米曲霉、黑曲霉以及根霉，其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果見表1。

表1 甜面醬中分離的霉菌形態(tài)觀察Table 1 The result of morphologic observation of moulds separated from sweet flour paste

由表1可知，M1號菌株，菌落疏松，生長繁殖較快，菌落初期呈現(xiàn)白色，后變?yōu)楹诤稚c基質(zhì)相接處假根發(fā)達，分枝多。顯微鏡下觀察，孢子囊呈球形，分生孢子呈橢圓形且為黃褐色，初步鑒定為根霉屬。M2，M3號菌落質(zhì)地疏松，初為白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色。顯微鏡下觀察，分生孢子頭呈放射狀，頂囊近似球形，初步鑒定為米曲霉屬。M4號菌株菌落最初為白色，形態(tài)近似圓形，表面粗糙，呈粉狀，菌絲為白色，孢子為黑色，在PDA培養(yǎng)基上正面為黑色，背面為白色。顯微鏡下觀察，分生孢子頭的頂囊近似球形，小梗雙層，第一層粗大，第二層相對短小，呈放射排列，布滿整個頂囊，呈現(xiàn)黑色，頂端有鏈形孢子，初步鑒定為黑曲霉屬。

2.2.2 細(xì)菌的分離與鑒定

從不同發(fā)酵時間段的甜面醬醬醪中，分離出5株典型細(xì)菌菌株。經(jīng)微生物形態(tài)學(xué)以及生理生化鑒定，初步確定有2株細(xì)菌為芽孢桿菌屬，其余3株分別為假單胞菌菌屬、鏈球菌屬及德克斯氏菌屬。細(xì)菌菌落及個體形態(tài)觀察鑒定結(jié)果見表2，細(xì)菌部分生理生化試驗測定結(jié)果見表3。

表2 甜面醬中分離的細(xì)菌形態(tài)觀察Table 2 The result of morphologic observation of bacteria separated from sweet flour paste

表3 細(xì)菌生理生化試驗結(jié)果Table 3 The result of physiological and biochemical test

由表2和表3可以初步判定X1和X3為芽孢桿菌屬，X2號菌株為假單胞菌屬，X4號菌株為鏈球菌屬，X5號菌株為德克斯氏菌屬。

2.3 甜面醬保溫發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌種的生理效價測定結(jié)果

2.3.1 霉菌生理效價測定結(jié)果

2.3.1.1 霉菌產(chǎn)蛋白酶及糖化酶能力比較

不同菌株產(chǎn)蛋白酶及糖化酶活力大小測定結(jié)果見圖2。

圖2 霉菌產(chǎn)蛋白酶及糖化酶能力的比較Fig.2 Comparation on capacity of producing protease and glucoamylase of moulds

由圖2可知，霉菌在傳統(tǒng)醬類釀制過程中的主要作用是分泌多種酶類，包括蛋白酶、糖化酶以及酯化酶等。在多種酶類的共同作用下，原料中的淀粉、蛋白等大分子物質(zhì)被降解為還原糖、多肽等小分子物質(zhì)，這些小分子進一步被分解代謝轉(zhuǎn)化，構(gòu)成甜面醬的主體呈香呈味物質(zhì)。因此，通過測定蛋白酶活力及糖化酶活力作為衡量菌株質(zhì)量優(yōu)劣的一個重要標(biāo)志。米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力高于根霉及黑曲霉菌株所產(chǎn)蛋白酶活力，產(chǎn)糖化酶活力較高的菌株為黑曲霉。就產(chǎn)兩種酶活能力大小而言，米曲霉及黑曲霉兩者可以相互彌補不足，因而可考慮將兩者混合應(yīng)用于面醬的釀制過程中。

2.3.1.2 霉菌產(chǎn)毒素的測定結(jié)果

試驗中分離而得的霉菌，考慮其有產(chǎn)黃曲霉毒素的可能［17，18］，因此需對分離而得的霉菌菌株檢測是否產(chǎn)毒素，從而確保菌株的安全性。采薄層色譜法檢測是否存在黃曲霉毒素，結(jié)果見表4。

表4 霉菌產(chǎn)黃曲霉毒素情況Table 4 Aflatoxin production by moulds

由表4可知，從甜面醬中分離而來的4株霉菌均不產(chǎn)黃曲霉毒素，可以認(rèn)為菌株具有使用安全性，能夠作為生產(chǎn)用的安全菌株。

2.3.2 細(xì)菌生理效價測定結(jié)果

通過測定總酸及氨基態(tài)氮的含量來反映5株優(yōu)勢細(xì)菌的產(chǎn)酸以及產(chǎn)氨基態(tài)氮的能力大小，細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸以及產(chǎn)氨基態(tài)氮含量測定結(jié)果見圖3。

圖3 細(xì)菌產(chǎn)酸及氨基態(tài)氮能力的比較Fig.3 Comparation on capacity of producing acid and amino nitrogen of bacteria

由圖3可知，甜面醬釀造過程中，細(xì)菌主要出現(xiàn)在發(fā)酵階段，細(xì)菌利用霉菌產(chǎn)酶降解生成的小分子糖類以及氨基酸等生長發(fā)酵產(chǎn)酸和氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)又構(gòu)成了醬類成品的風(fēng)味成分以及營養(yǎng)成分。鏈球菌產(chǎn)酸及氨基態(tài)氮的能力優(yōu)于其他菌株。有研究表明：鏈球菌屬中的乳鏈球菌被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)領(lǐng)域［19］。可考慮將鏈球菌屬菌株添加入保溫發(fā)酵后期，以增加總酸以及氨基態(tài)氮的含量，達到提高甜面醬品質(zhì)的目的。

3 結(jié)論

通過對甜面醬保溫發(fā)酵過程的菌相進行初步分析，保溫發(fā)酵前期微生物數(shù)量較多，隨著發(fā)酵進行，醬醪pH降低，溶氧量下降，微生物大量死亡，中后期生物量維持在較低水平，在整個保溫發(fā)酵過程中未檢測出酵母的存在。在甜面醬保溫發(fā)酵過程中，通過傳統(tǒng)分離方式獲得4株優(yōu)勢霉菌以及5株優(yōu)勢細(xì)菌，經(jīng)初步鑒定，4株霉菌包括2株米曲霉、1株根霉以及1株黑曲霉；5株優(yōu)勢細(xì)菌分別為2株芽孢桿菌屬、1株假單胞菌屬、1株鏈球菌屬以及1株德克斯氏菌屬。對優(yōu)勢霉菌菌株生理效價測定結(jié)果顯示：M2號米曲霉菌株產(chǎn)蛋白酶活力較高，黑曲霉菌株產(chǎn)糖化酶活力較高，通過檢測霉菌不產(chǎn)黃曲霉毒素，證明菌株有安全使用性，因此在后期研究中可以考慮將兩種菌株混合利用，彌補單一菌株酶活力的不足。細(xì)菌的生理效價檢測結(jié)果表明：鏈球菌屬菌株的產(chǎn)酸及氨基態(tài)氮能力強于其余4株菌，因而可考慮將鏈球菌屬菌株添加入保溫發(fā)酵后期，以增加總酸及氨基態(tài)氮含量，為提高甜面醬品質(zhì)提供一定參考。

［1］馮治平，吳士業(yè).酶促法甜面醬生產(chǎn)工藝條件研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（9）：358－360.

［2］李萍萍，鄧靜，吳華昌，等.甜面醬自然發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及酶活動態(tài)變化研究［J］.食品科技，2013（6）：290－294.

［3］黃明泉，王璐，張璟琳，等.甜面醬的鮮味成分分析［J］.現(xiàn)代食品科技，2015（2）：285－293.

［4］沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗［M］.北京：北京高等教育出版社，2007：28－34.

［5］Yang J，Yin K，Tan X，et al.Isolation and characterization of microbes from Pericarpium citri reticulatae［J］.Acta Microbiologica Sinica，2015，55（6）：700－706.

［6］中國科學(xué)院.常見與常用真菌［M］.北京：科學(xué)出版社，1978.

［7］羅雪云，劉宏道.食品衛(wèi)生微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)手冊［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

［8］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1973.

［9］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［10］布坎南，吉本斯.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（第八版）［M］.北京：科學(xué)出版社，1984.

［11］沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2014：618－619.

［12］SB／T 10317－1999，蛋白酶活力測定［S］.

［13］陳建民，張雪輝，楊美華，等.黃曲霉毒素檢測方法研究進展［J］.中國中藥雜志，2005，30（24）：1890－1894.

［14］劉紹.食品分析與檢驗［M］.武漢：華中科技大學(xué)出版社，2011.

［15］曾燦偉.甜面醬釀制過程中的菌相分析及風(fēng)味成分研究［D］.武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2009.

［16］沈芳，吳華昌，鄧靜，等.四川甜面醬不同發(fā)酵工藝中的菌相分析［J］.中國調(diào)味品，2013，38（6）：41－45.

［17］Chang P K，Scharfenstein L L，Solorzano C D，et al.High sequence variations in the region containing genes encoding a cellular morphogenesis protein and the repressor of sexual development help to reveal origins of Aspergillus oryzae［J］.Int J Food Microbiol，2015，200：66－71.

［18］Ling Li，Ye Zheng－mao，Wang Su－yuan，et al.Isolation and study on the aflatoxin genes of aflatoxin－producing fungi in paprika samples in Chengdu［J］.Journal of Sichuan University（Medical Science Edition），2015，46（5）：684－687.

［19］倪珊珊，黃麗英.乳酸鏈球菌素和乳酸乳球菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，2015，36（11）：244－247.

Research on Microorganism in Sweet Flour Paste during the Insulation Fermentation

YE Bi－xia，ZUO Yong＊，LAI Lin，CHEN Le－chun
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，China）

The number and species of microorganisms and the physiological potency of the main microorganisms are analyzed by the traditional methods of isolation and identification.The results show that the number of bacteria increases at the early storage time and then decreases，while the number of moulds gradually decreases，yeasts are not detected in sweet flour paste during the insulation fermentation.Four kinds of main moulds and five kinds of bacteria are acquired by traditional separation method，which include 2strains of Aspergillus oryzae，1strain of Aspergillus niger，1strain of Rhizopus sp.，2strains of Bacillus sp.，1strain of Pseudomonas sp.，1strain of Streptococcus sp.and 1strain of Dexter Escherichia sp.by preliminary identification.Physiological potency test results show that the ability to produce acid and amino nitrogen of Streptococcus sp.is the strongest，and the yield of acid and amino nitrogen is 1.2%and 0.43% respectively.The capacity of producing glucoamylase of Aspergillus nigeris relatively strong，and the ability is up to 352.33U／g.The ability to produce protease of Aspergillus oryzae M2is quite strong，approaching to 53.7U／g.

sweet flour paste；insulation fermentation；microorganism；physiological potency

TS264.24

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.017

1000－9973（2017）04－0080－05

2016－10－25 ＊通訊作者

四川省教育廳重大培育項目（15CZ0022）；2015大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（y2015011）

葉碧霞（1991－），女，碩士，研究方向：發(fā)酵工程；左勇（1972－），男，教授，主要從事發(fā)酵食品方面的研究。