韓融冰 趙玉卉 路等學(xué) 王 龍 秦 鵬

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

羊肚菌（Morchella sp.）是一種野生食用菌，又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，是子囊菌亞門（Ascomycotina）中著名的食用菌，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值，風(fēng)味鮮美，深受國內(nèi)外消費者的喜愛[1，2]。羊肚菌在我國主要分布于甘肅、四川、陜西、云南等地[3]?！吨腥A本草》記載：羊肚菌消食和胃，化痰理氣，主治消化不良，痰多咳嗽，還有防癌抗癌、預(yù)防感冒、增加人體免疫力的效果[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羊肚菌生物活性有效組分多糖的含量很高，其子實體多糖和液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的菌絲體多糖入藥有消積殺蟲的作用，增強人體免疫功能，還具有抗病毒、抗腫瘤作用，且能降低膽固醇含量，防止動脈硬化等功效[5]。由于羊肚菌栽培條件復(fù)雜，商品化栽培生產(chǎn)還難以實現(xiàn)，目前液體發(fā)酵成為利用該菌的重要途徑[1]。研究表明，由于中草藥中的成分（生物堿、皂苷、黃酮等）可促進或抑制藥用真菌菌絲體的生長及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[6]。筆者通過比較4種甘肅特色中藥甘草、當歸、黨參、板藍根提取液對羊肚菌菌絲生長的影響，篩選出有明顯促進作用的中藥種類和添加濃度，可為大規(guī)模培養(yǎng)羊肚菌菌絲體、并提取羊肚菌多糖提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料①菌種：羊肚菌4#，購自四川綿陽食用菌研究所。②中藥：甘草、當歸、黨參、板藍根（藥材級），購自甘肅德生堂大藥房。③培養(yǎng)基PDA：馬鈴薯（去皮）20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，用于添加量篩選試驗。液體培養(yǎng)基：玉米粉（煮汁）1%，黃豆粉（煮汁）0.5%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%。用于液體培養(yǎng)驗證試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 中藥提取液的制備[7]稱取100 g中藥，在500 mL水中浸泡1 h后用燒杯文火煎煮30 min，用四層紗布濾出藥汁，再在藥渣中加300 mL水煎煮，濾出藥汁，將兩次濾出的藥汁混合并定容至500 mL，備用。

1.2.2 中藥液添加濃度篩選試驗 將4種中藥提取液加入PDA培養(yǎng)基中，配置成6個質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基，提取液為25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL、150 mg/mL，空白對照組為不加中藥提取液的基本PDA培養(yǎng)基，制平板，每個處理5個平行。將活化培養(yǎng)（PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3～4 d）的羊肚菌菌絲體塊（直徑6 mm）接于各處理組和對照組平板中，25℃、避光培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長勢。如未篩選出理想的中藥濃度，則根據(jù)試驗的具體情況重新設(shè)定中藥提取液的濃度范圍。

每個中藥提取液選取促進羊肚菌生長的兩個最佳添加濃度進行搖瓶培養(yǎng)試驗。

1.2.3 液體搖瓶培養(yǎng)驗證 將菌種接入液體培養(yǎng)基中（接種塊的大小、厚薄以菌種塊浮在液面不沉下去為宜），25oC恒溫靜置培養(yǎng)2～3 d，待菌絲萌發(fā)后，25℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，制得羊肚菌液體菌種，備用。

根據(jù)平板上篩選出的最佳中藥提取液濃度范圍，在無菌條件下抽取30 mL制備好的羊肚菌液體菌種，接種到裝有添加中藥提取液的液體培養(yǎng)基（300 mL）的500 mL的三角瓶中，空白對照組不加中藥提取液。每組3個平行，25℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)液清澈結(jié)束培養(yǎng)，測定生物量[8]，以確定不同中藥提取液添加的最佳濃度。

1.2.4 菌絲體特征觀察 將轉(zhuǎn)接了菌絲體塊的各組平板置于25℃、避光條件下恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長勢，以菌絲即將長滿而未長滿平皿時作為測量終點，記錄培養(yǎng)天數(shù)，以接種塊為中心用刻度尺測量菌落直徑（mm），隨機測量3次，取平均值。計算菌絲日均長速[7]：

1.2.5 菌落干重測定[7]菌絲體培養(yǎng)到第7天時，將平板中的菌絲體連同培養(yǎng)基一并取出，放入盛有蒸餾水的搪瓷量杯中，每個平板對應(yīng)一個量杯，然后將量杯放在電磁爐上加熱，直至培養(yǎng)基完全液化，用玻璃棒挑出菌絲，并在加熱的蒸餾水中漂洗幾遍，取出后用濾紙吸去多余水分，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105oC烘至恒重后稱重。

1.2.6 搖瓶培養(yǎng)菌絲體生物量的測定[8]將發(fā)酵液移入離心管中在高速離心機4000 r/min離心30 min，把離心管底部的沉淀物用小勺移入180目的濾布中，用蒸餾水反復(fù)沖洗后將菌絲體移入培養(yǎng)皿中，再置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105oC烘至恒重后稱重[8]。

2 結(jié)果與分析

表1 不同質(zhì)量濃度甘草提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響

2.1 不同質(zhì)量濃度甘草提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響由表1可知，與對照相比，不同質(zhì)量濃度的甘草提取液對羊肚菌菌絲體生物量的積累有促進作用，在25～125 mg/mL，隨提取液添加質(zhì)量濃度的上升，雖然菌絲體生長速度逐漸變慢，但菌絲體生長密度逐漸增大，長勢旺盛，菌絲體生物量積累明顯增加，其中添加甘草提取物質(zhì)量濃度為125 mg/mL和150 mg/mL時效果最明顯，菌落干重分別達到191 mg和183 mg。

2.2 不同質(zhì)量濃度當歸提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響由表2可知，與對照相比，不同質(zhì)量濃度的當歸提取液對羊肚菌菌絲體生長有促進作用，在25～125 mg/mL，隨質(zhì)量濃度的增加，菌絲體生長速度逐漸變緩的同時菌絲體生長密度逐漸增大，長勢旺盛，得到的菌落干重也相應(yīng)增加，其中甘草提取物添加質(zhì)量濃度為125 mg/mL和150 mg/mL時效果最明顯，菌落干重分別達到248 mg和231 mg。

表2 不同質(zhì)量濃度當歸提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響

2.3 不同質(zhì)量濃度黨參提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響由表3可知，與對照相比，不同質(zhì)量濃度的黨參提取液對羊肚菌菌絲體生長有促進作用，在25～125 mg/mL，隨著濃度的增加，菌絲體生長速度逐漸變慢的同時菌絲體生長密度逐漸增大，長勢旺盛，得到的菌落干重也相應(yīng)增加。其中黨參提取物質(zhì)量濃度為100 mg/mL和125 mg/mL時效果最明顯，菌落干重分別達到177 mg和193 mg。

表3 不同質(zhì)量濃度黨參提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響

2.4 不同質(zhì)量濃度板藍根提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響與對照組相比，試驗設(shè)計6個處理對羊肚菌菌絲體的生長速度及生物量累積均有不同程度抑制作用，且隨著濃度不斷增加，抑制效果越明顯，所以重新選取5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL的板藍根提取液進行適宜質(zhì)量濃度篩選試驗。結(jié)果見表4。

由表4可知，選較低質(zhì)量濃度的板藍根提取液對羊肚菌菌絲體生長有一定促進作用，與對照相比，各處理組的菌絲體生長速度相對要慢，而菌絲體生長密度，在提取液濃度低于15 mg/mL時有所增加。板藍根提取物添加質(zhì)量濃度為5 mg/mL和10 mg/mL時效果相對較好，菌落干重分別達到121 mg和135 mg。

表4 不同濃度板藍根提取液對羊肚菌菌絲體生長的影響

表5 不同中藥提取液對羊肚菌液體培養(yǎng)菌絲體生長的影響

2.5 驗證試驗結(jié)果分別選取上述篩選出的各中藥提取液最佳添加量進行液體培養(yǎng)試驗，結(jié)果見表5。

由表5可知，與對照相比，添加4種甘肅特色中藥提取液后，羊肚菌液體培養(yǎng)所需天數(shù)（培養(yǎng)液清澈計天數(shù)）有所增加，但生物量積累大幅度提高，其中當歸的效果最佳，當添加質(zhì)量濃度為125 mg/mL時，羊肚菌菌絲生物量相比對照組增加110%，達到1.03 g/mL；其次是黨參和甘草，當添加質(zhì)量濃度分別為125 mg/mL時，生物量分別增加69.4%和57.1%，達到0.83 g/mL和0.77 g/mL；板藍根效果相對較差，當添加質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，生物量增加32.7%，達到0.65 g/mL。

3 小結(jié)與討論

4種供試中藥提取液對羊肚菌菌絲體生長速度有不同程度抑制作用，但對羊肚菌菌絲體生物量的積累有明顯的促進作用，其中當歸效果最明顯，添加質(zhì)量濃度為125 mg/mL時，羊肚菌液體培養(yǎng)生物量積累最佳。

以深層培養(yǎng)的發(fā)酵液和菌絲為主要原料提取羊肚菌胞外、胞內(nèi)多糖是羊肚菌多糖的重要來源之一[9]，羊肚菌發(fā)酵液中菌絲體生物量與胞外多糖產(chǎn)量呈正相關(guān)[10]。試驗為甘肅特色中藥在羊肚菌多糖生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。