韓瑞杰+王小花+張哲+李桂芹+劉海峰

[摘要]纖維化是導(dǎo)致器官功能慢性衰竭的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康。目前臨床上仍缺乏可有效逆轉(zhuǎn)纖維化的藥物。近年來，隨著對纖維化發(fā)生機(jī)制認(rèn)識的深入及分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程藥物在抗纖維化治療中日益發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]抗纖維化；基因生物工程藥物；現(xiàn)狀

[中圖分類號] R453 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）12（b）-0018-04

Current situation of research on genetic engineering drugs

HAN Rui-jie1，2 WANG Xiao-hua3 ZHANG Zhe1 LI Gui-qin2 LIU Hai-feng1

1.Medical Research Center，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China；2.Hongqi Hospital Affliatied to Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China；3.College of Basic Medical of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

[Abstract]Fibrosis is the main cause of chronic organ failure，which is harmful to human beings.There still no effective drugs which can reverse fibrosis in clinic.Recently，with the research on pathogenesis of fibrosis and the development of molecular biological technology，genetic engineering drugs play an important role in anti-fibrosis therapy.

[Key words]Anti-fibrosis；Genetic engineering drugs；Gurrent situation

器官纖維化已成為當(dāng)今危害人體健康的主要疾病之一，它是以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征的一種病理狀態(tài)，涉及多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和蛋白成分表達(dá)的改變，主要與細(xì)胞外基質(zhì)的生成及降解失衡有關(guān)[1]。纖維化的持續(xù)進(jìn)展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能衰竭，嚴(yán)重威脅人類生命健康。纖維化疾病可累及全身多個器官及系統(tǒng)，包括系統(tǒng)性硬化、移植物抗宿主硬皮病、特發(fā)性肺纖維化、肝硬化、進(jìn)展性腎病、心血管纖維化等[2]。雖然目前抗纖維化的藥物（細(xì)胞因子拮抗劑、膠原生物合成抑制劑和促進(jìn)膠原分解的抗纖維化藥物）取得良好的效果，但由于其制備周期長、造價昂貴等缺點而限制其臨床應(yīng)用。近年來，隨著基因工程技術(shù)取得巨大進(jìn)展，以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系為基礎(chǔ)，通過周密的分子設(shè)計，進(jìn)而利用基因工程技術(shù)來提高重組蛋白的活性，改善產(chǎn)品穩(wěn)定性，提高生物利用度，延長其在體內(nèi)的半衰期以及降低制品的免疫原性等優(yōu)點把蛋白質(zhì)改造成為合乎人類需要的蛋白質(zhì)，已成為新藥研發(fā)的新寵。基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術(shù)，把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源性DNA（目的基因）和載體DNA重組，最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源性基因DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)隨細(xì)胞的增殖而增殖。

1 Napsin A基因工程藥物

Napsin A是一種近年發(fā)現(xiàn)的新的天門冬氨酸蛋白酶，主要表達(dá)于Ⅱ型肺泡和腎近端小管細(xì)胞中，被公認(rèn)為是肺腺癌的標(biāo)志物[3]。Napsin A基因含有5個外顯子，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由1263 bp構(gòu)成，A編碼420個氨基酸的蛋白質(zhì)。Napsin A相對分子量是35 kDa，等電點為5.29，其一級結(jié)構(gòu)是由4部分構(gòu)成，24個氨基酸殘基組成的信號肽，40個氨基酸殘基組成的前肽區(qū)，336個殘基組成的功能區(qū)和18個殘基組成的C末端[4]，但近年來研究表明其表達(dá)水平與肺纖維化密切相關(guān)。Samukawa等[5]研究表明，在肺纖維化的患者血清中Napsin A明顯增加，提示管血清中Napsin A可作為臨床診斷肺纖維化的標(biāo)志物。Zheng等[6]采用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒和包膜表達(dá)質(zhì)粒三個部分構(gòu)建的慢病毒系統(tǒng)PLJM1-Napsin A，將其轉(zhuǎn)染至Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549的肺纖維化模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Napsin A基因的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的增殖能力明顯受到抑制，同時，上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平下降而間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物Fibronectin表達(dá)增加，可見Napsin A基因工程制品可以有效治療肺纖維化。

2 細(xì)胞球蛋白基因工程藥物

細(xì)胞球蛋白（Cytoglobin）屬于肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白，表達(dá)于各種組織的成纖維細(xì)胞中。Stone等[7]研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過依賴于FAK信號通路來調(diào)控Cytoglobin的表達(dá)，進(jìn)而影響纖維化的發(fā)生發(fā)展；進(jìn)一步研究表明Cytoglobin能夠負(fù)向調(diào)控肝星狀細(xì)胞的活化。Mimura等[8]研究表明，過表達(dá)Cytoglobin能改善組織的病理變化，保留腎功能和延緩纖維化的發(fā)生；同時表明Cytoglobin的這種保護(hù)作用與硝基酪氨酸的沉積和尿中羥基脫氧鳥苷的排泄密切相關(guān)。He等[9]使用基因工程的方法制備Cytoglobin，研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化SD大鼠模型中，Cytoglobin處理的SD大鼠纖維化程度明顯減輕，主要表現(xiàn)在反映肝纖維化等級的重要指標(biāo)（血漿天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及肝臟羥脯氨酸）的含量均明顯降低；同時抑制大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6的增殖和促進(jìn)其凋亡；進(jìn)一步研究表明，Cytoglobin抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）和促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，進(jìn)而增加了Bax/Bcl-2的比例，提示Cytoglobin通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑來在體內(nèi)外實驗中達(dá)到抗肝纖維化的目的，可見Cytoglobin基因工程藥物代表一種新穎的抗纖維化藥物。

3 肝細(xì)胞生長因子基因工程藥物

肝細(xì)胞生長因子（HGF）是酪氨酸激酶表面配體受體（c-Met）的有效激動劑，它與分散因子為同一分子，是重要的抗纖維化因子[10]，可介導(dǎo)細(xì)胞的生長、存活和運動，對組織的再生發(fā)揮有重要作用，但其自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，利用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的翻譯后修飾也很復(fù)雜，故哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)法制取重組人肝細(xì)胞生長因子（rhHGF）產(chǎn)量受到限制并且成本昂貴。Sonnenberg等[11]使用組合蛋白工程法，利用酵母菌系統(tǒng)大量生產(chǎn)出HGF工程片段（HGF-f）作為rhHGF的替代物，這種激動劑二聚體在體外實驗顯示出與rhHGF類似的功能。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，過表達(dá)HGF-f的心臟細(xì)胞中上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1及MMP-9的mRNA表達(dá)，同時下調(diào)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)因子-β1（TGF-β1）的表達(dá)。MMP-1和MMP-9在多種組織中能降解細(xì)胞外基質(zhì)來減輕纖維化，而TGF-β1在超過15種組織中能誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)來增加纖維化，提示HGF對纖維化疾病具有治療作用。重組蛋白HGF自身不穩(wěn)定，能迅速被廣泛表達(dá)在肝細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）螯合，這種天然分子同樣趨向于聚合。這些特征限制了活化的生長因子的數(shù)量，同時也限制了其在臨床上的應(yīng)用。HGF包含2條多肽鏈和6個結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域（N）、4個具有α重鏈的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域（K1～K4）和一個具有β輕鏈的絲氨酸蛋白酶同源結(jié)構(gòu)域，HGF對HSPG有兩個結(jié)合位點：高親和力的在N結(jié)構(gòu)域、低親和力的在K1結(jié)構(gòu)域。NK1是HGF自然生成的剪接變體，編碼N結(jié)構(gòu)域和K1結(jié)構(gòu)域，Ross等[12]通過蛋白質(zhì)工程手段生成了NK1的突變體1 K1（K132E∶R134E），它的K1結(jié)構(gòu)域HSPG低親和力結(jié)合位點通過Lys132和Arg134的反相電荷突變被破壞掉，這改變了K1表面的靜息電位。研究顯示1 K1工程蛋白和天然HGF蛋白具有相似的促人初級肝細(xì)胞增生和抗凋亡的功能，并且1 K1具有更好的溶液穩(wěn)定性，在Balb/c小鼠4周的CCl4誘導(dǎo)肝纖維化期間內(nèi)給予1 K1直至小鼠被處死，天狼星紅染色切片的結(jié)果表明，與對照組比較，1 K1組肝纖維化明顯減少了19%，ALT水平減少了30%。以上研究表明，肝細(xì)胞生長因子工程藥物具有抗纖維化的功能。

4轉(zhuǎn)化生長因子Ⅱ型受體TβRⅡ基因工程藥物

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，在纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，被公認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖、活化、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積的促進(jìn)劑，其中TGF-β1在纖維化中起主要作用[13]。TGF-β1參與細(xì)胞的生長分化，組織器官的胚胎發(fā)育，損傷后修復(fù)等多種生物學(xué)效應(yīng)，特別是對ECM的沉積和抑制MMPs起著重要的作用[14-15]。TGF-β的生物學(xué)功能是通過與其細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合來實現(xiàn)的。TGF-β有2個主要的細(xì)胞膜受體：TGF-β Ⅰ型受體（TβRⅠ）和TGF-β Ⅱ型受體（TβRⅡ）均為穿膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是信號傳導(dǎo)所必需的，兩者結(jié)構(gòu)類似，均包括膜外區(qū)域、單跨膜區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)區(qū)域。其中TβRⅡ可單獨與TGF-β結(jié)合，而TβRⅠ必須在TβRⅡ與TGF-β結(jié)合的條件下才能與TGF-β結(jié)合[16]，因此，TGF-β的生物學(xué)功能取決于TGF-β的活化和TβRⅡ的存在[17]。阻斷TGF-β信號傳導(dǎo)通路，便可有效的抑制過表達(dá)的TGF-β所引發(fā)的纖維化。Liu等[18]應(yīng)用腺病毒載體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)游離型全長TβRⅡ基因至靶細(xì)胞，其與野生型的TβRⅡ競爭結(jié)合TGF-β1，導(dǎo)致部分野生型受體無法結(jié)合到TGF-β1而達(dá)到抑制TGF-β1功能的目的。Chu等[19]研究表明，通過篩選截短型的TβRⅡ，能與野生型的TβRⅡ競爭結(jié)合纖維化過程中產(chǎn)生的TGF-β1，進(jìn)一步抑制纖維化細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)。Liu等[20]研究表明，通過基因克隆手段擴(kuò)增截短型的TβRⅡ，通過原核表達(dá)制備截短型TβRⅡ，作用于纖維化的細(xì)胞中，不但抑制纖維化細(xì)胞的增殖，而且抑制纖維化相關(guān)的膠原蛋白的表達(dá)。郁子揚等[21]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)大鼠sTβRⅡ-IFNγ（sTβRⅡ-IFNγ）融合蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，采用pSecTag2/TβRⅡ-IFNγ真核表達(dá)質(zhì)粒直接肌肉注射法基因治療，其明顯減少二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)的大鼠HSC活化，減少α-SMA和ECM表達(dá)，減輕肝纖維化程度，且其效果較單獨sTβRⅡ或IFNγ表達(dá)質(zhì)粒更明顯。以上研究表明，截短型的TβRⅡ是一種更為安全、穩(wěn)定和有效地治療纖維化的蛋白藥物。

5 角質(zhì)細(xì)胞生長因子基因工程藥物

角質(zhì)化細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）是成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）家族中的第七個成員，它介導(dǎo)多種組織中表（上）皮細(xì)胞增殖和分化來調(diào)控肺上細(xì)胞的損傷[22]。Yao等[23]研究表明，KGF通過調(diào)控音猥因子（SHH）信號通路來激活干細(xì)胞的分化，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)低氧誘導(dǎo)的肺纖維化。Sakamoto等[24]研究表明，腺病毒過表達(dá)KGF可降低博來霉素誘導(dǎo)的纖維化的小鼠的致死率，說明KGF能達(dá)到抑制纖維化發(fā)生。于程程等[25]研制出中性粒細(xì)胞抑制因子（neutrophil inhibitory factor，NIF）-KGF雙重功能的基因嵌合體，隨后的小鼠實驗表明該嵌合體蛋白能明顯抑制急性肺損傷后循環(huán)內(nèi)白細(xì)胞的增加和博來霉素誘導(dǎo)的肺炎及肺纖維化，提示其可用于治療肺纖維化和其它涉及白細(xì)胞活化浸潤及組織纖維化的多種臨床疾病。

綜上所述，工程藥物具有活性高、毒性低、特異性強(qiáng)、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用的特點。由于其成本低、成功率高、安全可靠，故已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分。但蛋白質(zhì)相對分子量大、對蛋白分解酶敏感及在生物體內(nèi)血漿清除快、口服絕對生物利用度低，因此大多數(shù)治療性蛋白藥物由靜脈、肌內(nèi)和皮下注射，其給藥途徑受限。同時，由于該類藥物為外源性蛋白，其物理化學(xué)性質(zhì)與小分子藥物不同，藥動學(xué)和藥效學(xué)研究面臨許多困難，而且穩(wěn)定性不高、在體內(nèi)半衰期短、需頻繁給藥、生物利用率低等缺點，在生理和心理上對患者造成極大的負(fù)擔(dān)。未來應(yīng)進(jìn)一步完善工程藥物的藥動學(xué)和藥效學(xué)研究及藥物的長效性的研究，以獲得理想的治療效果。另外，對于其安全性及倫理性方面的問題也存在爭議，這些問題能否妥善解決都將影響整個產(chǎn)業(yè)的發(fā)展前景。

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