海藻酸鈉包埋法固定L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的研究

王靜，揣玉多，湯衛(wèi)華，侯婷

（1.天津市輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津300350；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

海藻酸鈉包埋法固定L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的研究

王靜1，2，揣玉多2，湯衛(wèi)華2，侯婷2

（1.天津市輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津300350；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

以海藻酸鈉為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化。研究海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、戊二醛濃度以及硬化時(shí)間等因素對(duì)固定化效果的影響。結(jié)果表明最佳固定化條件為：海藻酸鈉濃度3.5%，氯化鈣濃度3.0%，戊二醛濃度0.2%，硬化時(shí)間7 h，該條件下制備的固定化酶與游離酶相比，最適宜反應(yīng)溫度和pH值基本沒有變化，并且具有較好的操作穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性。

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶；固定化；海藻酸鈉；戊二醛

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶是一種胞內(nèi)酶，能催化合成D-塔格糖、L-核酮糖等稀有功能糖，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要應(yīng)用[1-3]。其中L-核酮糖可經(jīng)過一步生物催化轉(zhuǎn)化得到L-核糖，L-核糖在食品和藥物上具有巨大的潛在生物活性，而L-核酮糖是制備L-核糖最有效的生物合成途徑，其中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶是生物法生產(chǎn)L-核酮糖最有效的酶之一[4-6]。近年來，國內(nèi)外研究報(bào)道一些可用來發(fā)酵生產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的微生物，但這些微生物產(chǎn)酶水平均較低[7-9]，若以游離酶形式生產(chǎn)L-核酮糖，存在添加量偏大且不利于產(chǎn)品的分離純化等缺點(diǎn)，造成生產(chǎn)成本高，不利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。而固定化可以使酶具有酶活穩(wěn)定、易回收、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，這樣可以減少L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的使用量，從而相應(yīng)地降低L-核酮糖的生產(chǎn)成本。本文以海藻酸鈉為載體，對(duì)影響L-阿拉伯糖異構(gòu)酶固定化的主要因素進(jìn)行研究，并研究固定化后L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)，為固定化L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（酶活42.6 U/mL）：天津現(xiàn)代學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室自制；海藻酸鈉、無水氯化鈣、25%戊二醛溶液、硫酸、咔唑、無水乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-阿拉伯糖、L-核酮糖、2-（N-嗎啉代）磺酸基乙烷（MES）、半胱氨酸鹽酸鹽：Sigma公司。

UV-5500紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)、電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HNY2012C恒溫?fù)u床：上海百典儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶的固定化

將10 mL充分溶解的海藻酸鈉溶液與5 mL的游離酶液混合攪拌。用6號(hào)針頭的注射器將上述混合液以60滴/min的速度滴入氯化鈣溶液中，即形成大小均一的光滑顆粒，0℃～4℃條件下靜置硬化一定時(shí)間。將固定化酶顆粒洗滌、抽濾干燥。再加入到一定濃度的戊二醛溶液中，室溫（25℃）下振蕩交聯(lián)1 h，傾去溶液，分別用0.9%氯化鈉和去離子水洗滌固定化酶顆粒，抽濾干燥即得固定化酶，0℃～4℃條件下保存。

1.2.2 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶酶活的測(cè)定

游離酶1 mL或固定化酶1 g加入50 mmol/L底物L(fēng)-阿拉伯糖（pH7.5，MES緩沖溶液配制），50℃反應(yīng)30 min，HCl停止反應(yīng)，離心除去酶蛋白，將上清液適當(dāng)稀釋后，按BK法[10]測(cè)定L-核酮糖的濃度，并計(jì)算酶活。

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活定義為：以L-阿拉伯糖為底物，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1 μg的L-核酮糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的相對(duì)酶活：設(shè)定同組酶活最高的相對(duì)酶活為100%，以同組最高酶活為參照，計(jì)算出的比值為相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響

取不同濃度的海藻酸鈉溶液10 mL與5 mL游離酶液混合，用注射器將上述溶液逐滴加到2.0%的氯化鈣溶液中，硬化4 h，測(cè)定酶活，結(jié)果見圖1。

圖1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化效果的影響Fig.1 Effect of the concentration of sodium alginate on the immobilization

由圖1可知，海藻酸鈉濃度為3.5%時(shí)，固定化酶具有相對(duì)較高的酶活，且成型均勻，凝膠強(qiáng)度適中。海藻酸鈉濃度過低或過高都會(huì)導(dǎo)致固定化酶酶活降低。這可能是由于海藻酸鈉濃度太低時(shí)，形成的凝膠結(jié)構(gòu)孔徑較大，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，酶容易流失；而海藻酸鈉濃度較高時(shí)，溶液黏度過高，溶解困難，推壓注射器費(fèi)力且形成的固定化顆粒拖尾，形狀不規(guī)則，酶結(jié)構(gòu)受到影響，導(dǎo)致酶活降低。因此，選擇海藻酸鈉溶液濃度為3.5%。

2.1.2 氯化鈣溶液濃度對(duì)固定化效果的影響

取3.5%濃度的海藻酸鈉溶液10 mL與5 mL游離酶液混合，用注射器將上述溶液逐滴加到不同質(zhì)量濃度的氯化鈣溶液中，硬化4 h，測(cè)定酶活，結(jié)果見圖2。

圖2 氯化鈣濃度對(duì)固定化效果的影響Fig.2 Effect of the concentration of calcium chloride on the immobilization

由圖2可知，氯化鈣濃度低于3.0%時(shí)，固定化酶活力隨著氯化鈣濃度的增加而增大，氯化鈣濃度為3.0%時(shí)相對(duì)酶活達(dá)100%；而氯化鈣濃度大于3.0%后，相對(duì)酶活隨著氯化鈣濃度的增大而逐漸減小。這可能是由于氯化鈣濃度太低時(shí)凝膠交聯(lián)度不夠，包埋不完全，酶易流失，而氯化鈣濃度太大時(shí)，形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑小，高分子聯(lián)結(jié)緊密，影響底物分子的擴(kuò)散及其與酶的結(jié)合，不利于酶活性的發(fā)揮。因此，選擇氯化鈣溶液濃度為3.0%。

2.1.3 硬化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響

保持其他固定化條件不變，分別將固定化顆粒硬化不同時(shí)間，測(cè)定酶活，結(jié)果見圖3。

圖3 硬化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響Fig.3 Effect of the solidifying time on the immobilization

由圖3可知，隨著硬化時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶的相對(duì)酶活增大；當(dāng)硬化時(shí)間為6 h時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)100%；硬化時(shí)間再延長(zhǎng)，相對(duì)酶活逐漸降低。這主要是開始硬化時(shí)，隨著硬化時(shí)間的延長(zhǎng)，包埋逐漸緊密，酶被包埋的越充分和牢固，酶流失減少，固定化酶活性逐漸增大；但硬化時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致固定化酶交聯(lián)程度高，空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于緊密，增加了底物擴(kuò)散的阻力，固定化酶的相對(duì)活性降低。因此，選擇硬化時(shí)間為6 h。

2.1.4 戊二醛濃度對(duì)固定化效果的影響

海藻酸鈉包埋酶分子易泄漏，固定化酶操作穩(wěn)定性較差，半衰期短。戊二醛作為一種雙功能試劑，可以使海藻酸鈉分子交聯(lián)，同時(shí)也使酶交聯(lián)在載體上，增強(qiáng)了固定化酶的穩(wěn)定性。取不同質(zhì)量濃度的戊二醛溶液，考察其對(duì)固定化酶的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 戊二醛濃度對(duì)固定化效果的影響Fig.4 Effect of the concentration of flutaraldehyde on the immobilization

由圖4可知，戊二醛濃度在0.2%時(shí)，固定化酶活的相對(duì)酶活最高，戊二醛濃度進(jìn)一步增大造成固定化酶的活力下降。這主要是由于戊二醛濃度過高時(shí)，使酶蛋白變性失活，酶活降低。因此，選擇戊二醛濃度為0.2%。

2.1.5 酶固定化條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以酶活力為考察指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化酶的固定化條件，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

由表2可以看出海藻酸鈉濃度（A）、氯化鈣濃度（B）、硬化時(shí)間（C）和戊二醛濃度（D）組合A2B2C3D2最好，即海藻酸鈉濃度為3.5%，氯化鈣濃度為3.0%，硬化時(shí)間為7 h，戊二醛濃度為0.2%。在此條件下，固定化酶的酶活力可達(dá)16.2 U。

2.2 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 固定化酶的最適反應(yīng)溫度

取適量游離酶和固定化酶，在30℃～70℃溫度范圍內(nèi)反應(yīng)，測(cè)定酶活，結(jié)果見圖5。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Orthogonal results

圖5 溫度對(duì)固定化酶和游離酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the immobilized enzyme and free enzyme

由圖5可知，固定化酶的最適溫度范圍變化不大。

2.2.2 固定化酶的最適反應(yīng)pH值

取游離酶和固定化酶，在pH 6～8.5范圍內(nèi)反應(yīng)，測(cè)定酶活，結(jié)果見圖6。

圖6 pH值對(duì)固定化酶和游離酶活力的影響Fig.6 Effect of pH value on the immobilized enzyme and free enzyme

由圖6可知，游離酶被固定化后最適反應(yīng)pH值為7.2，而游離酶的最適pH值為7.5，可見酶經(jīng)固定化以后最佳反應(yīng)pH值和游離酶相比發(fā)生了較小的偏移。這可能是由于載體的性質(zhì)引起的微小變化。

2.2.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

取適量固定化酶顆粒，在相同反應(yīng)條件下連續(xù)進(jìn)行7批次操作，并測(cè)定其酶活力，結(jié)果見圖7。

圖7 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.7 The operation stability of immobilized enzyme

由圖7可知，隨著固定化酶重復(fù)操作次數(shù)的增加，固定化酶效率緩慢降低。這主要是由于凝膠反復(fù)利用，機(jī)械強(qiáng)度下降，酶泄露導(dǎo)致利用率降低，但連續(xù)操作7次后，固定化酶相對(duì)酶活仍在55%以上，說明固定化酶有較好的操作穩(wěn)定性。

2.2.4 固定化酶的貯存穩(wěn)定性

分別取固定化酶和游離酶保存于0℃～4℃冰箱中，每隔4天取出測(cè)定兩者的殘余酶活，結(jié)果見圖8。

圖8 固定化酶貯存穩(wěn)定性Fig.8 The storage stability of immobilized enzyme

由圖9可知，經(jīng)過20 d的貯存，固定化酶仍保持85%的催化活性，而游離酶卻只有35%的活性，這說明固定化酶比游離酶具有更好的貯存穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

以海藻酸鈉為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)L－阿拉伯糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化，研究得出制備固定化酶的最優(yōu)條件為：海藻酸鈉濃度3.5%，氯化鈣濃度3.0%，硬化時(shí)間6 h，戊二醛濃度0.2%，該條件下制備的固定化酶與游離酶相比，最適宜反應(yīng)溫度和pH值基本沒有變化。固定化后L-阿拉伯糖異構(gòu)酶具有較好的操作穩(wěn)定性，重復(fù)操作7次后相對(duì)酶活仍在55%以上。

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Research on the Immobilization of L-Arabinose Isomerase by Embedded in Sodium Alginate

WANG Jing1，2，CHUAI Yu-duo2，TANG Wei-hua2，HOU Ting2
（1.Tianjin Light Industry Chemical Reseach Institute Co.，Ltd.，Tianjin 300350，China；2.Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China）

L-alabinose isomerase（L-AI）was immobilized using sodium alginate as the carrier and flutaraldehyde as the crosslinker.The effects of the concentration of sodium alginate，calcium chloride and flutaraldehyde，the solidifying time were studied.The results showed that the optimal immobilization condition were as followed：sodium alginate 3.5%，calcium chloride 3.0%，flutaraldehyde 0.2%and the solidifying time 7 h. Under the optimum condition，compared with the free L-AI，the optimum pH value and temperature of immobilized L-AI were not changed.The immobilized L-AI had good operational stability and storage stability.

L-alabinose isomerase；immobilization；sodium alginate；flutaraldehyde

2017-05-05

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（15YFFCTG00130）

王靜（1978—），女（漢），副教授，博士，研究方向：精細(xì)化學(xué)品合成與應(yīng)用的研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.020