夏炳江張 磊胡松峰王 寧侯明生

（1.浙江省紹興市中醫(yī)院，浙江 紹興 312000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

·研究報(bào)告·

纖維環(huán)穿刺結(jié)合TNF-α注射構(gòu)建大鼠尾椎間盤退變模型的實(shí)驗(yàn)研究*

夏炳江1，2△張 磊2胡松峰1王 寧1侯明生1

（1.浙江省紹興市中醫(yī)院，浙江 紹興 312000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

目的觀察X線透視下纖維環(huán)穿刺結(jié)合腫瘤壞死因子-α（TNF-α）椎間盤內(nèi)注射構(gòu)建大鼠尾椎間盤退變模型的可行性。方法取3月齡清潔級(jí)SD大鼠96只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、對(duì)照組（B組）和實(shí)驗(yàn)組（C組）各32只。C組大鼠在X線透視輔助下，利用0.6mm穿刺針穿刺尾椎5～6椎間隙（Co5/6），穿刺成功后，以微量注射器向椎間盤內(nèi)注入TNF-α（10 ng/μL）25μL。B組大鼠在椎間盤穿刺成功后注入25μL生理鹽水，A組大鼠不做任何處理。采用50%機(jī)械性撤足閾值、椎間隙相對(duì)高度、椎間盤組織學(xué)改變及椎間盤聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因表達(dá)評(píng)價(jià)大鼠尾椎間盤退變情況。結(jié)果造模后，C組大鼠50%機(jī)械性撤足閾值明顯降低，椎間隙相對(duì)高度逐漸下降，HE染色顯示椎間盤出現(xiàn)明顯退變表現(xiàn)，椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)下降，表明模型構(gòu)建成功，與B組大鼠相比，C組大鼠誘發(fā)的椎間盤退變過程出現(xiàn)更早，進(jìn)展更快，程度更重。結(jié)論X線透視下纖維環(huán)穿刺結(jié)合TNF-α椎間盤內(nèi)注射是一種可行的建立大鼠尾椎間盤退變模型的方法，其所誘發(fā)的椎間盤退變過程出現(xiàn)更早，進(jìn)展更快，程度更重。

椎間盤退變 TNF-α 動(dòng)物模型 針刺

椎間盤退變性疾?。―DD）因椎間盤退變的病因和病理生理機(jī)制尚未完全闡明，故目前尚無理想的治療方法。建立一種合理、規(guī)范的椎間盤退變動(dòng)物模型能夠?yàn)檠芯孔甸g盤退變發(fā)生及發(fā)展機(jī)制提供有利條件，同時(shí)為驗(yàn)證各種干預(yù)措施修復(fù)退變椎間盤有效性提供良好的實(shí)驗(yàn)載體。目前，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，在椎間盤退變發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視。大量文獻(xiàn)證實(shí)，退變椎間盤組織中TNF-α表達(dá)明顯增高［1-2］，且與人類盤源性腰痛的發(fā)生密切相關(guān)［3］。故本研究擬采用傳統(tǒng)的纖維環(huán)針刺法結(jié)合外源性TNF-α椎間盤內(nèi)注射的方法構(gòu)建大鼠尾椎間盤退變模型，并采用行為學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)及分子生物學(xué)等方法評(píng)價(jià)椎間盤退變情況，以期建立一種穩(wěn)定，可重復(fù)，且與人類椎間盤退變具有類似表現(xiàn)的動(dòng)物模型?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠96只，12周齡，體質(zhì)量 （220± 20）g，所有SD大鼠均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 （實(shí)驗(yàn)動(dòng)物號(hào)：SYXK-浙-2008-0115），每籠4只，喂食普通顆粒飼料，室溫（20±2）℃，自然光照，保持良好通風(fēng)，自由進(jìn)水進(jìn)食。

1.2 試劑與儀器

Von Frey纖毛儀（美國(guó)Stoelting），多光譜小動(dòng)物活體成像儀（美國(guó)Carestream Health），全自動(dòng)組織脫水機(jī)（日本櫻花），輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica），顯微鏡及顯微拍攝系統(tǒng)（德國(guó)Leica），BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) （成都泰盟科技有限公司），TNF-α（上海生工），Trizol提取液（上海生工），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，大連），定量試劑盒（TAKARA，大連），PCR引物（上海生工）。

1.3 分組與造模

將96只大鼠，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)原則，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、對(duì)照組（B組）和實(shí)驗(yàn)組（C組）各32只。C組大鼠在X線透視下，采用傳統(tǒng)的纖維環(huán)針刺法結(jié)合外源性TNF-α椎間盤內(nèi)注射的方法構(gòu)建尾椎間盤退變模型，具體方法如下：所有SD大鼠術(shù)前禁食6 h，利用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。取仰臥位，在X線透視引導(dǎo)下，利用0.6mm穿刺針穿刺尾椎5/6椎間隙（Co5/6）。當(dāng)穿刺針進(jìn)至椎間盤中心后，以微量注射器向椎間盤內(nèi)注入TNF-α（10 ng/μL）25μL，停留約10 s后出針。術(shù)后肌肉注射青霉素10000 U預(yù)防感染，持續(xù)3 d，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。B組大鼠在椎間盤穿刺成功后注入25μL生理鹽水，其他干預(yù)措施同C組大鼠。A組大鼠不做任何處理。

1.4 標(biāo)本采集及檢測(cè)

分別于造模前及造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每組各取8只大鼠測(cè)定50%機(jī)械性撤足閾值、椎間盤相對(duì)高度、椎間盤組織學(xué)改變及聚蛋白聚糖與Ⅱ型膠原（Col2）mRNA表達(dá)水平。

1.4.1 50%機(jī)械性撤足閾值測(cè)定 采用經(jīng)典 “Up-Down”方法測(cè)定大鼠造模前及造模后1 d、3 d、1周、2周、4周、6周50%機(jī)械性撤足閾值，判定其是否產(chǎn)生病理性疼痛，該閾值與疼痛呈負(fù)相關(guān)［4］。為消除心理環(huán)境因素的干擾，測(cè)試前先將大鼠置于測(cè)試裝置內(nèi)1 h，使其適應(yīng)環(huán)境，等待大鼠完全安靜后開始試驗(yàn)。采用不同強(qiáng)度的von Frey hairs分別對(duì)大鼠后足足趾施加機(jī)械性刺激，測(cè)試時(shí)保持von Frey hairs垂直、微彎曲，刺激時(shí)間為6 s，期間若大鼠出現(xiàn)快速撤足即為陽性反應(yīng)。若撤足反應(yīng)為陰性，則增加1級(jí)刺激強(qiáng)度，若撤足反應(yīng)為陽性，則將刺激強(qiáng)度減小1級(jí)。如此反復(fù)，以第1個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的前1點(diǎn)為起點(diǎn)，連續(xù)6次的刺激結(jié)果為最終的撤足反應(yīng)模式。通過特定的程序?qū)⒊纷惴磻?yīng)模式轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的撤足閾值。

1.4.2 椎間盤相對(duì)高度測(cè)量 在造模前及造模后第2、4、6周將大鼠麻醉后，行尾椎X線檢查 （距離6.59英寸；曝光時(shí)間19 s；電壓50 kV）。檢查時(shí)將大鼠尾保持平直，檢測(cè)后即時(shí)數(shù)字化成像，將影像學(xué)資料輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，采用雙盲法對(duì)其進(jìn)行處理。Co5/6椎間盤相對(duì)高度測(cè)量方法［5］：將椎間盤寬度四等分，測(cè)量中點(diǎn)及其兩側(cè)各位點(diǎn)相鄰椎體及椎間盤的高度，計(jì)算椎間盤高度指數(shù) （DHI）=椎間盤高度平均值/椎體高度平均值，以DHI變化率（DHI%）代表椎間盤高度的變化，即DHI%=術(shù)后DHI%/術(shù)前DHI%×100%。

1.4.3 椎間盤組織學(xué)觀察 在造模前及造模后第2、4、6周將大鼠Co5/6椎間盤（連同上、下部分椎體）用10%磷酸鹽緩沖液甲醛固定72 h，14%EDTA液脫鈣14 d，按常規(guī)脫水、透明、包埋、石蠟切片，厚約3～4μm，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察椎間盤髓核、纖維環(huán)以及交界區(qū)的組織學(xué)形態(tài)。根據(jù)纖維環(huán)與髓核的退變程度，各自評(píng)分（0～3分）。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［6］執(zhí)行。其中1分為輕度退變，2分為中度退變，3分為重度退變。

1.4.4 椎間盤聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 完整切取大鼠Co5/6椎間盤，利用液氮迅速冷凍后將其研磨成粉。利用Trizol提取液提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以合成的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR所需引物序列［7］見表1。以GAPDH基因作為內(nèi)參照，測(cè)量聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)。上述指標(biāo)均重復(fù)測(cè)量2次，取其平均值。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。多組間的差異比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況

本試驗(yàn)中所有SD大鼠均存活，無意外死亡等情況發(fā)生。所有SD大鼠造模前均行X線檢查，以排除先天性尾椎畸形及椎間隙狹窄等情況存在。

2.2 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)50%機(jī)械性撤足閾值測(cè)定結(jié)果比較

見表2。造模前各組大鼠50%機(jī)械性撤足閾值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。造模后各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，A組大鼠50%機(jī)械性撤足閾值，與基礎(chǔ)閾值比較，均無明顯改變（P>0.05）。B組大鼠50%機(jī)械性撤足閾值在造模后第1天下降，造模后第3天有所回升，7 d后維持在穩(wěn)定水平至造模后6周，與A組大鼠同時(shí)間點(diǎn)閾值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組大鼠50%機(jī)械性撤足閾值從造模后第1天開始下降，至第7天降至最低，并保持在低水平至造模后6周，與A組及B組大鼠同時(shí)間點(diǎn)閾值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。

表2 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)50%機(jī)械性撤足閾值比較（±s）

表2 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)50%機(jī)械性撤足閾值比較（±s）

與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與造模前1 d比較，△P＜0.05。下同。

造模后組 別 n 造模前1d 1d 3d 1周 2周 4周 6周A組 8 22.32±8.39 23.12±7.43 21.56±8.22 22.54±7.25 23.02±9.34 22.35±8.72 23.48±9.38 B組 8 24.67±9.79 8.34±2.37*△9.16±3.03*△14.34±3.13*△15.76±2.74*△14.66±3.13*△14.17±3.55*△C組 8 23.02±8.62 5.32±1.11*#△4.33±1.45*#△2.04±0.75*#△3.02±0.72*#△2.36±0.64*#△2.53±0.88*#△

2.3 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)Co5/6椎間盤DHI%測(cè)量結(jié)果比較

見表3。造模前各組大鼠DHI比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，A組大鼠DHI%，與造模前比較，均無明顯改變（P>0.05）。B組大鼠DHI%在造模后逐漸下降，與A組大鼠同時(shí)間點(diǎn)DHI%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組大鼠DHI%在造模后明顯下降，與A組及B組大鼠同時(shí)間點(diǎn)DHI%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)Co5/6椎間盤DHI%比較（%，±s）

表3 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)Co5/6椎間盤DHI%比較（%，±s）

組別 n 造模前1 d 造模后A組 8 B組 8 2周 4周 6周100 100 100 100 100 80.76±10.32*△70.66±13.16*△70.17±14.22*△C組 8100 60.35±10.72*#△52.33±9.23*#△50.19±10.29*#△

2.4 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)Co5/6椎間盤組織學(xué)觀察比較

見表4。A組大鼠在造模后第2、4、6周Co5/6椎間盤組織形態(tài)學(xué)無明顯異常改變，纖維環(huán)膠原纖維排列有序，髓核與纖維環(huán)界限清晰，髓核組織中間可見較多的脊索細(xì)胞和類軟骨細(xì)胞，分布均勻。B組大鼠在造模后2周，Co5/6椎間盤組織HE染色呈大致正常椎間盤組織學(xué)表現(xiàn)。造模后4周，開始出現(xiàn)纖維環(huán)板層狀結(jié)構(gòu)被破壞，髓核呈皺縮狀，髓核細(xì)胞數(shù)量減少，但髓核內(nèi)仍可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)和規(guī)律的細(xì)胞。C組大鼠在造模后2周即開始出現(xiàn)纖維環(huán)排列紊亂、裂隙及斷裂，纖維環(huán)與髓核交界區(qū)變窄，髓核組織被破壞，其中部分髓核組織被成纖維結(jié)締組織取代。

表4 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)Co5/6椎間盤HE染色評(píng)分比較（分，±s）

表4 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)Co5/6椎間盤HE染色評(píng)分比較（分，±s）

組別 n 造模前1 d 造模后A組 8 B組 8 2周 4周 6周0 0 0 0 0 1.00±0.71*△2.40±0.89*△3.00±1.22*△C組 80 3.24±0.83*#△3.84±0.84*#△4.80±1.30*#△

2.5 各組大鼠造模前后各時(shí)間點(diǎn)Co5/6蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果比較

見表5。造模前各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后第2、4、6周，B組與C組大鼠蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA，與造模前比較，均有明顯下降（P<0.05），其中C組大鼠蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA下降更明顯，與B組大鼠同時(shí)間點(diǎn)相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表5 各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)比較（±s）

組別 造模前1 d 造模后2周 4周 6周A組 1.10±0.20 1.13±0.28 1.22±0.25 1.18±0.23（n＝8） 1.05±0.08 1.10±0.10 1.11±0.09 1.07±0.11 B組 1.21±0.24 0.70±0.07*△0.74±0.05*△0.62±0.03*△（n＝8） 1.08±0.07 0.74±0.06*△0.63±0.07*△0.61±0.02*△C組 1.02±0.21 0.54±0.02*#△0.50±0.04*#△0.52±0.03*#△（n＝8） 1.11±0.11 0.48±0.05*#△0.40±0.06*#△0.42±0.02*#△

3 討 論

3.1 椎間盤退變模型構(gòu)建方法

建立的椎間盤退變動(dòng)物模型要求與人類的椎間盤退變具有相似性和可比性，應(yīng)能再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律，可重復(fù)，且所選動(dòng)物的解剖結(jié)構(gòu)與生理特點(diǎn)盡可能與人類接近，同時(shí)，應(yīng)考慮經(jīng)濟(jì)因素和操作可行性［8］。目前利用大鼠建模較多，價(jià)格相對(duì)低廉、飼養(yǎng)方便，雖然其椎間盤較小，但解剖結(jié)構(gòu)及生化成份與人類椎間盤相近［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，作者采用SD大鼠來構(gòu)建椎間盤退變模型。

纖維環(huán)損傷法是目前最常采用的椎間盤退變?cè)炷７椒?，其中以針刺纖維環(huán)造模法應(yīng)用較廣泛［10］。目前，TNF-α表達(dá)增高是椎間盤退變及下腰痛的重要病理生理學(xué)特征［11-12］。

本研究采用在X線透視下纖維環(huán)穿刺聯(lián)合外源性TNF-α椎間盤內(nèi)注射的方法來建立大鼠尾椎間盤退變模型。該法建立的椎間盤退變模型最大的特點(diǎn)是使用存在于退變椎間盤內(nèi)的細(xì)胞因子TNF-α，能夠更好的模擬椎間盤退變的病理生理過程，與單純纖維環(huán)穿刺法相比更接近椎間盤退變的客觀規(guī)律。

3.2 模型退變的效果評(píng)估

3.2.1 疼痛行為學(xué) 與椎間盤正常生理性衰老不同，病理性椎間盤退變的重要特征是可誘發(fā)疼痛，故對(duì)椎間盤退變模型進(jìn)行疼痛評(píng)估，顯得非常重要。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)造模大鼠50%機(jī)械性撤足閾值從造模后第1天開始下降，至第7天降至最低，并保持在低水平至造模后6周，與A組及B組大鼠同時(shí)間點(diǎn)閾值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此，我們認(rèn)為模型大鼠疼痛閾值降低，與臨床椎間盤退變誘發(fā)疼痛現(xiàn)象類似，故該模型有助于研究和評(píng)估新藥物或治療技術(shù)緩解盤源性疼痛的療效。

3.2.2 影像學(xué)指標(biāo) 椎間盤組織在X線上雖然無法直接顯示，但仍可通過間接觀察椎間隙高度及椎緣骨質(zhì)改變來推測(cè)椎間盤的變化，以判斷椎間盤退變的嚴(yán)重程度［13］。既往研究已證明在X線片上測(cè)量到的椎間隙高度改變與椎間盤的組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果有較高的相關(guān)性［14］。在本研究中，筆者觀察到大鼠椎間隙在造模后明顯下降（P<0.05），提示造模后椎間盤出現(xiàn)明顯退變。與單純穿刺法相比，C組大鼠椎間隙高度丟失更早、更快及更嚴(yán)重，提示X線透視下纖維環(huán)穿刺結(jié)合TNF-α椎間盤內(nèi)注射是一種可行的建立大鼠尾椎間盤退變模型的方法，其所誘發(fā)的椎間盤退變過程出現(xiàn)更早，進(jìn)展更快，程度更重。

3.2.3 組織形態(tài)學(xué) 通過HE染色和其他不同的特殊染色對(duì)椎間盤組織進(jìn)行評(píng)價(jià)分析是目前評(píng)估椎間盤退變最準(zhǔn)確的方法。當(dāng)椎間盤發(fā)生退變時(shí)，纖維環(huán)，髓核及軟骨終板均會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變［15］。在本研究中，大鼠在造模后2周即開始出現(xiàn)纖維環(huán)排列紊亂、裂隙及斷裂，纖維環(huán)與髓核交界區(qū)變窄，髓核組織被破壞，其中部分髓核組織被成纖維結(jié)締組織取代，提示椎間盤退變模型建立成功。此外，我們研究亦發(fā)現(xiàn)，與單純穿刺法相比，聯(lián)合應(yīng)用TNF-α椎間盤內(nèi)注射可更快誘導(dǎo)椎間盤出現(xiàn)退變。

3.2.4 分子生物學(xué) 研究表明，椎間盤退變是由細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝與分解代謝的動(dòng)態(tài)平衡被打破造成的，其中分解代謝因素更重要［16］。聚蛋白聚糖是椎間盤中蛋白多糖的主要類型。聚蛋白聚糖的降解，被認(rèn)為是軟骨退變?cè)缙诘闹匾笜?biāo)。聚蛋白聚糖降解可致后續(xù)的Ⅱ型膠原纖維降解，后者在穩(wěn)定椎間盤自身結(jié)構(gòu)及對(duì)抗外界壓力負(fù)荷上具有重要的作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，造模大鼠聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA明顯下降，與對(duì)照組大鼠同時(shí)間點(diǎn)相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些改變與人類椎間盤退變的病理過程與生化改變規(guī)律類似。

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An Experimental Study of the Construction of Caudal Intervertebral Disc Degeneration M odel in Rats by Anulus Fibrosus Puncture Combined w ith TNF-αInjection

XIA Bingjiang，ZHANG Lei，HU Songfeng，etal.Shaoxing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Shaoxing 312000，China.

Objective：To study the feasibility of the construction of caudal intervertebral disc degeneration model in rats by anulus fibrosus puncture combined with TNF-αinjection.M ethods：96 SD rats were divided randomly into the blank group（group A，n=32），the control group（group B，n=32）and the experimental group（group C，n=32）.In group C，the coccygeal intervertbral discs in rats at Co5-6 were punctured by 0.06 mm needle and

25μL of TNF-α（10 ng/μL）.In group B，the coccygeal intervertbral discs in rats at Co5-6 were punctured by 0.06 mm needle and received 25μL normal saline.In group A，no interventions were taken.The caudal intervertebral disc degeneration was evaluated by 50%mechanicalwithdrawal threshold，intervertebral disc relative height，intervertebral disc histological changes and intervertebral disc proteoglycan and collagen typeⅡgene expression.Results：Aftermodeling，the 50%mechanicalwithdrawal threshold decreased；intervertebral disc relative height reduced；intervertebral disc histological changed，HE staining showed visible disc degeneration；the gene expression of proteoglycan and collagen type II intervertebral disc decreased.All these showed the model was successful.Compared with group B，the process of intervertebral disc degeneration in group C appeared earlier，faster，and more serious.Conclusion：In X-ray fluoroscopy，anulus fibrosus puncture combined with TNF-α injection is a feasiblemethod for the establishment of caudal intervertebral disc degeneration model in rats.The process of intervertebral disc degeneration induced by thismethod appeared earlier，faster，and more serious.

Intervertebral disc degeneration；TNF-α；Animalmodel；Needle puncture

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1167-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.011

2017-03-29）

浙江省紹興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015B70060）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016ZB132）

△通信作者（電子郵箱：xiabj2006@163.com）