白木香結(jié)香樹脂部?jī)?nèi)生真菌的分離及其結(jié)香菌篩選

黃秋偉+王麗萍+黃顯雅+黃惠芳+李慧敏

摘要：采用平板培養(yǎng)法對(duì)白木香結(jié)香部位內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，以沉香主要成分芐基丙酮作為結(jié)香菌的耐藥指標(biāo)，采用改進(jìn)的菌塊法進(jìn)行耐藥能力的篩選。結(jié)果表明，從結(jié)香部位分離出11株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子初步鑒定歸于3目4科5屬，其中在數(shù)量上，鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)種群，其次為木霉屬。經(jīng)芐基丙酮耐藥篩選發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬的G7耐藥水平較高，對(duì)芐基丙酮的劑量變化不敏感，將其選作人工結(jié)香菌，效果有所顯現(xiàn)，結(jié)香時(shí)間大為縮短。

關(guān)鍵詞：白木香；內(nèi)生真菌；芐基丙酮；人工結(jié)香

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0285-05

白木香[ Aquilaria sinensis（Lour.） Gilg]為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）植物，別稱土沉香、女兒香、莞香，為我國(guó)特有的珍貴藥用樹種，主產(chǎn)于海南、廣東、廣西等?。▍^(qū)）。其含黑色樹脂的木質(zhì)部稱為沉香，系《中國(guó)藥典》收載的品種，是目前緊缺的名貴藥材和天然香料，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥狀[1]。目前，由于白木香的野生資源少，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，自然條件下沉香的形成最少也要10年以上的時(shí)間，而且并不是所有的白木香都能形成沉香，所以即使通過人工種植白木香，也很難解決天然沉香產(chǎn)量問題，不能滿足市場(chǎng)需求。健康的白木香并不產(chǎn)生樹脂，據(jù)目前研究表明，沉香形成機(jī)理是健康的白木香樹干在受到損傷或者刺激情況下，其木質(zhì)部細(xì)胞分泌出一種氣味芬芳的防御性黑色樹脂，而這種防御性機(jī)制的引發(fā)主要與白木香受損后的微生物浸染有很大關(guān)系。

內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌，被感染的植物不表現(xiàn)明顯的外在病癥，可通過組織學(xué)方法，從表面嚴(yán)格消毒的植物組織中分離的方法，以及從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增微生物DNA 的方法來證明其內(nèi)生性[2]。對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的研究表明，內(nèi)生真菌與藥用植物在長(zhǎng)期的生活過程中，形成了互惠互利的共生關(guān)系，不但可以自身合成與宿主植物相類似活性成分，還具有促進(jìn)宿主植物合成活性成分的能力。對(duì)于促進(jìn)結(jié)香的內(nèi)生真菌首先在一定程度上對(duì)沉香活性成分具有耐受性。沉香的成分比較復(fù)雜，主要成分有三大類：倍半萜、2-苯乙基色酮類物和芳香族化合物，芐基丙酮、對(duì)甲氧基芐基丙酮是沉香芳香族化合物的代表性成分。近年來，我國(guó)珍稀瀕危藥用植物內(nèi)生真菌及其活性成分的研究成為了藥物開發(fā)的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外從多種藥用植物內(nèi)生真菌中篩選出各種生理活性成分陸續(xù)見有報(bào)道，且發(fā)現(xiàn)有一些活性成分具有與宿主植物相同或相似的生理活性[3]。因此，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究較多的是關(guān)于沉香內(nèi)生真菌分離及其次生代謝產(chǎn)物活性成分，而對(duì)于促進(jìn)結(jié)香的內(nèi)生菌研究報(bào)道仍較少。本研究對(duì)已結(jié)香的沉香部分進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和鑒定，選用芐基丙酮作為試驗(yàn)條件對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行結(jié)香耐藥性篩選，并通過人工結(jié)香試驗(yàn)，篩選出對(duì)白木香結(jié)香具有良好促進(jìn)作用的菌株，為加快天然沉香的結(jié)香周期奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 白木香樣品于2014年7月采自廣西壯族自治區(qū)靈山縣武利鎮(zhèn)魚良村當(dāng)?shù)匾恢陿潺g為100年白木香古樹。因古樹比較高大，根系深入地底，所以根部及葉片的組織樣品難以取得，取材部位為莖部的天然結(jié)香樹脂部分。白木香樣品采集后于48 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒。取樣的樹種經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所鑒定白木香。

1.1.2 主要儀器及試劑 徠卡DM2500型光學(xué)顯微鏡；DYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀；伯樂GEL DOCXR全自動(dòng)凝膠成像儀；德國(guó)Biometra Tprofessional 96梯度PCR儀；LRH-250GB光照恒溫培養(yǎng)箱；日本三洋MLS-3780高壓蒸汽滅菌器；離心柱型真菌基因組DNA提取試劑盒，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；PCR產(chǎn)物純化及回收試劑盒，由BIOMIGA公司生產(chǎn)；Taq PCR master mix試劑，由上海捷瑞生物工程有限公司生產(chǎn)；芐基丙酮試劑，由Sigma-aldrich公司生產(chǎn)；吐溫80，由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 所用培養(yǎng)基 白木香內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，硫酸鏈霉素100 mg，氯霉素 100 mg，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；純化培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）；白木香培養(yǎng)基：未結(jié)香白木香碎木塊（7年樹齡）100 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；液體PDA培養(yǎng)基。

上述培養(yǎng)基所用的馬鈴薯與白木香均煮沸30 min后，4層紗布過濾，再補(bǔ)水至1 000 mL，滅菌條件為121 ℃，18 min，硫酸鏈霉素與氯霉素均在培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃時(shí)加入。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 內(nèi)生真菌的分離采用組織塊平板培養(yǎng)法[4-5]，用于分離的白木香天然結(jié)香木塊材料采用自來水沖洗1遍，并將腐爛的木質(zhì)部去除，然后切割成 5 cm×5 cm的木塊，依次用75%乙醇洗1 min，無菌水漂洗1次，5%次氯酸鈉溶液漂洗5 min，無菌水漂洗4次。消毒后的材料置于無菌的干燥濾紙上吸干水分，用無菌手術(shù)刀刮去木塊表面組織，并切成1 cm×1 cm的小塊置于分離培養(yǎng)基上，采用三角形法，每個(gè)平板放置3個(gè)小塊，以最后一次沖洗的無菌水0.1 mL涂板作為陰性對(duì)照，來檢驗(yàn)表面消毒是否徹底。28 ℃恒溫培養(yǎng)直到出現(xiàn)菌落，從菌落邊緣挑取菌絲接種于純化培養(yǎng)基上，經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接純化后的菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的試管斜面，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定利用肉眼觀察分離菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征；采用真菌學(xué)插片培養(yǎng)法和水滴裝片法，利用光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察，根據(jù)菌落形態(tài)特征（包括菌落大小、顏色、表面特征和質(zhì)地等）和顯微形態(tài)特征（包括菌絲和孢子等）參考文獻(xiàn)[6]對(duì)白木香結(jié)香樹脂部位的分離菌株進(jìn)行初步鑒定。endprint

分子鑒定先采用液氮研磨，試劑盒提取方法制備真菌總DNA。真菌樣品采取的是菌膜培養(yǎng)法，具體參考陳亮等的研究[7]，從活化好的PDA平板中挑取1接種環(huán)菌絲，放入25 mL PDA液體培養(yǎng)基于26 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h，充分混勻后，在靜止培養(yǎng)5～7 d形成菌膜，然后挑取菌膜放入研缽，加入液氮并快速研磨成粉末，將粉末分成2份分裝于2.5 mL離心管，一份于-80 ℃保存?zhèn)溆茫环萦糜贒NA提取，提取操作按照試劑盒方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向）擴(kuò)增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃溫育10 min。PCR產(chǎn)物利用BIOMIGA公司生產(chǎn)的純化回收試劑盒純化，純化后的產(chǎn)物由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行核酸測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI的BLAST進(jìn)行序列的同源性檢索比對(duì)。

1.2.3 內(nèi)生真菌的芐基丙酮耐受性篩選試驗(yàn) 初篩：將保存于試管斜面的菌種轉(zhuǎn)接于新鮮的PDA培養(yǎng)基中，于26 ℃培養(yǎng)活化以作為供試菌。配制白木香培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻到50～60 ℃，往培養(yǎng)基里滴加0.10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）吐溫80作為乳化劑，然后選取體積分?jǐn)?shù)為0.08%加入沉香主要成分之一的芐基丙酮，快速混勻后倒平板。內(nèi)生真菌對(duì)芐基丙酮具有耐受能力的初步篩選采用菌餅法，先用6 mm的打孔器在接有活化好的內(nèi)生真菌的PDA平板上打出直徑約為6 mm的圓形菌餅，然后用滅菌接種針各挑取1塊圓形菌餅置于含芐基丙酮的白木香培養(yǎng)基平板中央，同時(shí)以置于不含芐基丙酮的白木香培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均設(shè)置3次重復(fù)，置于26 ℃下恒溫避光培養(yǎng)4 d后，觀察真菌的生長(zhǎng)狀況，以菌圈直徑（包括菌餅）作為耐受性指標(biāo)，計(jì)算芐基丙酮對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率，選取對(duì)芐基丙酮具有耐受性的菌株進(jìn)行復(fù)篩，生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算公式如下：

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-6 mm）×100%。

復(fù)篩：設(shè)置含芐基丙酮0.10%、0.12%、0.14% 3個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的白木香平板，并將具有耐受性的菌株轉(zhuǎn)接于含藥平板中，轉(zhuǎn)接方法與初篩試驗(yàn)中菌餅轉(zhuǎn)接法一致，置于 26 ℃ 下恒溫避光培養(yǎng)7 d后，觀察真菌的生長(zhǎng)狀況，以菌落長(zhǎng)勢(shì)及菌圈直徑（包括菌餅）作為耐受能力指標(biāo)，并通過菌絲生長(zhǎng)抑制率濃度曲線，選取對(duì)芐基丙酮耐受能力較強(qiáng)的菌株作為結(jié)香菌。

所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算對(duì)照組與處理組、處理組與處理組間的顯著性差異。

1.2.4 結(jié)香菌人工結(jié)香的初步試驗(yàn) 將篩選出來的菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上活化，挑取活化后的菌絲（連同培養(yǎng)基）轉(zhuǎn)接到裝有500 mL液體PDA培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，于26 ℃、120 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d。液體培養(yǎng)物先后經(jīng)慢速濾紙及0.45 μm微孔濾膜抽濾，收集濾液，得到菌體發(fā)酵液 4 ℃ 備用。選取7～8年樹齡的白木香作為試驗(yàn)植株，在離地面50 cm處用電鉆打孔，之后將含有發(fā)酵液的注射袋的注射頭插入孔隙，吊帶注射一段時(shí)間，觀察孔隙口邊緣是否漏液及注射袋是否脹袋，以判別液體是否成功注射入樹體中。接菌注射3個(gè)月后，通過觀察注射孔徑位置是否變色，并取其部分材料進(jìn)行燃燒試驗(yàn)，觀察其燃燒狀況，來初步判定結(jié)香狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白木香樹脂部?jī)?nèi)生真菌的分離與鑒定結(jié)果

本次研究采用組織塊平板分離法，經(jīng)過多次分離純化后，從白木香的樹脂形成部位分離獲得11株內(nèi)生真菌，根據(jù)PDA平板上的分離次序、形態(tài)及培養(yǎng)特征依次進(jìn)行菌株編號(hào)G1、G2，…，G11。經(jīng)過顯微形態(tài)觀察及分子鑒定，將分離得到的內(nèi)生真菌初步鑒定為3目4科5屬，相關(guān)分離結(jié)果見表1。分離的5個(gè)菌屬依次為鐮刀菌屬、木霉屬、毛色二孢屬、絲孢屬、黏孢屬。其中，鐮刀菌屬有5株，占分離菌株數(shù)的45%，為結(jié)香部位的優(yōu)勢(shì)菌群；木霉屬有3株，占分離菌株數(shù)27%；其余屬各有1株，各占分離菌株數(shù)的9%。在觀察鑒定試驗(yàn)中，鐮刀菌屬與木霉屬培養(yǎng)特征比較明顯。鐮刀菌屬在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)前期產(chǎn)生大量的白色氣生菌絲，并呈現(xiàn)棉絮狀，培養(yǎng)后期不產(chǎn)生色素或者產(chǎn)生黃色、紅色等色素，分生孢子梗主要單生，分生孢子呈鐮刀形或卵圓形；木霉屬在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)前期氣生菌絲為白色，生長(zhǎng)密集呈網(wǎng)叢狀，培養(yǎng)后期菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色或黃色，分生孢子梗呈二叉狀或三叉狀分枝，分生孢子球形。

2.2 內(nèi)生真菌耐藥菌的篩選

2.2.1 內(nèi)生真菌芐基丙酮初篩結(jié)果 由表2可知，芐基丙酮對(duì)所分離的11株菌均產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。從對(duì)比差異來看， 鐮刀菌屬的內(nèi)生真菌有3株的對(duì)照組與處理組表現(xiàn)出極顯著性差異；2株的對(duì)照組與處理組無明顯差異，分別是G7與G8，說明這2株菌受芐基丙酮的影響較小，耐受能力較為明顯。木霉屬的內(nèi)生真菌有2株表現(xiàn)出顯著性差異，1株為極顯著差異。其余3個(gè)屬的內(nèi)生真菌均表現(xiàn)極顯著差異。從菌落生長(zhǎng)抑制率效果來看，鐮刀菌屬的5株真菌所受抑制率各不相同，抑制率由小到大排列，依次為G7毛色二孢屬>絲孢屬，抑制率分別為64.02%、53.54%、48.01%，抑菌值與鐮刀菌屬和木霉屬的大多數(shù)真菌相比相差較大，說明這3個(gè)菌屬的耐受能力較弱。綜合上述兩方面考慮，初篩試驗(yàn)選取G7、G8、G9、G10這4株真菌作為芐基丙酮的耐受菌，由圖1可知，4株內(nèi)生真菌耐藥試驗(yàn)及分生孢子的顯微形態(tài)。

2.2.2 內(nèi)生真菌芐基丙酮復(fù)篩結(jié)果 將初篩得到的4株真菌再次進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，由表3可知，各個(gè)菌的對(duì)照組與處理組生長(zhǎng)情況相差明顯，且總體趨勢(shì)是隨著芐基丙酮體積分?jǐn)?shù)提高，抑制生長(zhǎng)的效果越明顯。在0.08%芐基丙酮處理中沒有顯著性差異鐮刀菌屬的G7、G8，在體積分?jǐn)?shù)提高到0.10%后，與對(duì)照組相比也出現(xiàn)了極顯著性差異。然而，鐮刀菌各個(gè)體積分?jǐn)?shù)處理間的菌落生長(zhǎng)狀況均沒有明顯差別；木霉屬的各個(gè)體積分?jǐn)?shù)處理間均表現(xiàn)出了顯著性差異，甚至有些處理還出現(xiàn)了極顯著性差異，說明這2株木霉屬真菌對(duì)芐基丙酮變化量較敏感。此外，由圖2可知，在0.10%、0.12%、014%培養(yǎng)條件下，木霉屬的整體抑制率是低于鐮刀菌屬的，但從抑制率的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)分析，木霉屬增長(zhǎng)幅度波動(dòng)性較大，尤其是體積分?jǐn)?shù)0.14%時(shí)，與0.12%抑制率相比，增長(zhǎng)幅度達(dá)到了約 15.00%，說明木霉屬的G9、G10等2株真菌對(duì)于高濃度芐基丙酮耐受能力較低；鐮刀菌屬的增長(zhǎng)幅度比較平緩，各個(gè)濃度的增長(zhǎng)幅度基本維持在2.00%～5.00%，G7各個(gè)體積分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)幅度較為均等，且抑制率水平較其他2株鐮刀菌屬真菌要低一些，說明該菌的芐基丙酮耐受能力水平較高，因此選用G7作為人工接菌結(jié)香的結(jié)香菌源。

2.3 人工結(jié)香試驗(yàn)初步結(jié)果

經(jīng)發(fā)酵液注射過后的白木香樹木，先出現(xiàn)掉葉枯枝的假死現(xiàn)象，后經(jīng)過一段適應(yīng)期長(zhǎng)出新枝嫩葉。用砍刀將菌種發(fā)酵液注射孔及其周圍的表皮去掉后，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)孔洞周圍的木質(zhì)部已經(jīng)發(fā)黑變色，變色方向主要是向兩端縱向延伸。變色部分的剖面面積約為1.0 cm×3.5 cm，通過旋轉(zhuǎn)取樣器深入取樣，深入樹干9.0 cm取出，發(fā)現(xiàn)取樣器的頂端帶有小部分白色木質(zhì)組織，表明變色樹脂的橫向深度約為9.0 cm。將取出的黑色木塊組織肉眼觀察無腐化爛木現(xiàn)象，且經(jīng)燃燒試驗(yàn)后無異味黑煙，而是白色帶有淡香的煙氣。初步認(rèn)為，變色樹脂部分為沉香，所篩選的耐藥菌可以促進(jìn)結(jié)香，圖3為注射菌液后的白木香生長(zhǎng)及切面狀況。

3 討論

內(nèi)生真菌普遍存在于植物中，但不同的植物體內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量有差別，即使是同一種植物，也會(huì)因生境、品種和年齡等不同而分離出不同的內(nèi)生真菌，加上不同的表面消毒程序和分離培養(yǎng)條件及污染控制，也會(huì)造成一定的差異。本試驗(yàn)從白木香的結(jié)香樹脂部位分離得到11株真菌，顯示內(nèi)生真菌多樣性較低。同時(shí)，在分離數(shù)量上，鐮刀菌屬為結(jié)香部位的優(yōu)勢(shì)屬，這些結(jié)果與已報(bào)道的白木香內(nèi)生真菌相比較，既有差異又有相似。張秀環(huán)等從樹齡為7年的白木香健康部位和樹脂形成部位共分離出42株內(nèi)生真菌，其中健康部位15株，樹脂形成部位27株，結(jié)香部位真菌分布優(yōu)于健康組織，此外，該研究還發(fā)現(xiàn)枝頂孢霉屬為健康部位優(yōu)勢(shì)菌屬，青霉屬為結(jié)香部位優(yōu)勢(shì)菌屬[8]。王磊等對(duì)不同樹齡白木香和不同的組織部位進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離鑒定，共分離得到50株真菌，但不同樹齡及組織得到的真菌數(shù)量各不相同，從樹齡分布來看，5年樹齡分離數(shù)量最多，30年樹齡次之，10月樹齡最少。他們還發(fā)現(xiàn)，在不同健康組織（根、莖、葉）和結(jié)香組織分離得到的真菌數(shù)量上，健康組織33株，結(jié)香部位17株，健康組織分布優(yōu)于結(jié)香部位，而分離出來的鐮刀菌全部位于結(jié)香樹脂部位，是該部位的優(yōu)勢(shì)種群[9]。造成這種真菌數(shù)量種群差異性和結(jié)香種群優(yōu)勢(shì)專一性的原因可能是植物不同部位的微環(huán)境不同，如化學(xué)成分等內(nèi)在因素，以及種植環(huán)境條件外在因素影響了內(nèi)生真菌的浸染和多樣性。

鐮刀菌屬[10]（Fusarium Link）是重要的菌物類群，是人類發(fā)現(xiàn)的重要植物病原菌之一，自然界中兼寄生或腐生生活。該屬真菌可侵染多科植物（茄科、豆科、禾本科、蘭科、松科、錦葵科、藜科、葫蘆科、十字花科、蕓香科和百合科等）引起苗枯、穗腐、根腐、莖腐、穗軸腐爛、冠腐和植物種子、塊莖的腐爛等癥狀[11]。此外，有些鐮刀菌還可直接侵染動(dòng)物和人類引起嚴(yán)重的疾??；有些可分解纖維素、降解有機(jī)物，有助于自然界的物質(zhì)循環(huán)；有些可寄生在昆蟲或其他真菌上，作為生防菌被利用；有的在一定培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生激素，用于刺激動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。此外，鐮刀菌屬一般的分類鑒定主要是以大小分生孢子形態(tài)、培養(yǎng)性狀等形態(tài)學(xué)特征建立的形態(tài)學(xué)種，但由于該菌屬會(huì)因?yàn)槠浞诸愋誀钜鬃兦也环€(wěn)定，造成種內(nèi)分化和顯著差異，這給實(shí)際鑒定帶來許多困難。本次試驗(yàn)分離得到的5株鐮刀菌，相似菌種為腐皮鐮刀菌，但菌落在培養(yǎng)基上面的次生代謝產(chǎn)物（如色素有無及色澤）彼此不同，觀察形態(tài)有些有共同特征（如菌落生長(zhǎng)大小、孢子著生方式），也有些結(jié)構(gòu)有明顯差異（如孢子大?。┖湍推S基丙酮能力的差異，這些可能都是由種內(nèi)分化造成的。在耐藥性篩選試驗(yàn)中，看似同種的5株鐮刀菌，各自的耐芐基丙酮能力及抗藥水平均有差異，導(dǎo)致這些差異的發(fā)生極有可能是由于種內(nèi)分化，從而使菌體內(nèi)的微結(jié)構(gòu)及代謝功能發(fā)生改變。對(duì)于鐮刀菌的結(jié)香效果，一些文獻(xiàn)上也有所報(bào)道。例如，Tabata等利用包括三線鐮孢（Fusarium trifosfrium）在內(nèi)的5種鐮刀菌進(jìn)人工結(jié)香試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)通過接種能產(chǎn)生沉香[13]。Kazzaz等通過對(duì)印尼沉香樹的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌（F. laseritum）能促進(jìn)白木香結(jié)香[14]。這些結(jié)果都與本次研究結(jié)果一致，說明鐮刀菌對(duì)于開發(fā)白木香的結(jié)香技術(shù)有著重要作用，尤其是耐芐基丙酮藥性的鐮刀菌。

此外，由于沉香成分復(fù)雜，芐基丙酮只是其中的主要成分之一，有些真菌可能不耐芐基丙酮，但會(huì)對(duì)其他沉香成分有著協(xié)同促進(jìn)作用。本試驗(yàn)分離得到1株毛色二孢屬真菌，韓曉敏等研究發(fā)現(xiàn)的與其同屬的可可毛色二孢菌類發(fā)酵液對(duì)白木香產(chǎn)生沉香主要成分-倍半萜有著誘導(dǎo)促進(jìn)作用，而且發(fā)酵液產(chǎn)物成分里面也出現(xiàn)了與沉香倍半萜類相一致的成分[15]。因此，筆者認(rèn)為分離出來的毛色二孢屬也很有可能具備這一誘導(dǎo)作用，并產(chǎn)生倍半萜類化合物，但其本身對(duì)芐基丙酮耐受力較差。因此，還須對(duì)侵染結(jié)香的沉香組織進(jìn)行物理提取及GC-MS檢測(cè)，來分析其內(nèi)在成分與天然結(jié)香的成分差異，以及多個(gè)菌屬之間優(yōu)化搭配，發(fā)揮協(xié)同作用來促進(jìn)結(jié)香，提高結(jié)香品質(zhì)。endprint

4 結(jié)論

本次研究從結(jié)香部位分離出11株內(nèi)生真菌，并從中篩選出1株耐芐基丙酮內(nèi)生菌，將該菌通過發(fā)酵培養(yǎng)后，對(duì)白木香進(jìn)行人工的菌液注射侵染結(jié)香，一段時(shí)間后得到變色木質(zhì)組織，經(jīng)過初步驗(yàn)證，具備沉香的表觀性質(zhì)，且形成周期比自然形成時(shí)間要短很多，說明所選耐藥菌對(duì)促進(jìn)白木香結(jié)香、加快結(jié)香時(shí)間有良好的效果，因而耐芐基丙酮能力可以作為篩選人工結(jié)香菌的重要指標(biāo)之一，且方法可行。

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