李玲，陳凱，王貽蓮，張薇，楊玉忠，扈進冬，李紀順*

(1.山東省科學院生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250014； 2.農業(yè)部農藥檢定所，北京 100026)

高產Monacolin K紅曲菌種的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

李玲1，陳凱1，王貽蓮1，張薇2，楊玉忠1，扈進冬1，李紀順1*

(1.山東省科學院生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250014； 2.農業(yè)部農藥檢定所，北京 100026)

為了提高Monacolin K的產量，應用30 keV的N+離子注入，對紫紅曲霉M2 進行誘變育種。誘變劑量分別為1×1015，5×1015，1×1016，5×1016，1×1017N+/cm2，通過構巢曲霉對峙培養(yǎng)、洛伐他汀抗性篩選、高效液相色譜HPLC方法篩選高產Monacolin K的優(yōu)秀突變菌株，并且通過液態(tài)發(fā)酵試驗優(yōu)化部分培養(yǎng)條件。結果顯示：相對原菌株M2，最佳誘變菌株11-13產Monacolin K的能力是原菌株M2的2.3倍，連續(xù)傳代5次，其高產遺傳形狀穩(wěn)定。其最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃，接種量10%，轉速200 r/min，發(fā)酵時間14 天。

紅曲霉；Monacolin K；N+離子注入；誘變育種；發(fā)酵條件

紅曲米是由紅曲霉接種大米后發(fā)酵而來，由于其產品豐富和發(fā)酵產物中含多種有益代謝物，因此受到世界范圍尤其是亞洲國家的關注，尤其是中國在食品和醫(yī)藥的使用上已有千余年歷史[1-3]。紅曲米的發(fā)酵產物包括色素、Monacolin類化合物、γ-氨基丁酸、多肽、吡喃吲哚類生物堿等有益代謝物質[4-6]，其中Monacolin K(別名：洛伐他汀)是一種膽固醇合成抑制劑，能夠降低血脂，降低動脈粥樣硬化程度，促進惡性甲狀腺細胞的凋亡，抑制人類惡性乳房腫瘤細胞增殖等[7-13]，并且其發(fā)酵產物中還存在一系列不飽和脂肪酸等生理活性物質，能夠降低純品Monacolin K的副作用，協(xié)同Monacolin K共同發(fā)揮作用[14]，因此Monacolin K極具市場潛力，然而由于菌種產Monacolin K的水平低下，影響和制約了它的工業(yè)化生產，所以提高Monacolin K產量是亟需解決的問題，其中優(yōu)良紅曲菌株的選育是實現(xiàn)大規(guī)模生產的一種有效方法。

目前，改良菌種的常用手段為誘變，而離子束注入是目前微生物誘變育種的高效誘變技術，該方法是物理和化學誘變的綜合體，利用離子注入微生物細胞內，引起微生物體內DNA或染色體等發(fā)生變化，人工定向選育得到新品種[15]。因此本試驗選用N+離子注入對紅曲霉M2進行誘變，并且對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期得到高產Monacolin K的紅曲誘變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紫色紅曲霉菌種M2，由本實驗室篩選，于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

Monacolin K標準品 Sigma公司；色譜甲醇 Fisher公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；葡萄糖、蔗糖、甘油、蛋白胨、NaCl、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4等化學試劑均為國產分析純；大豆蛋白粉、酵母粉等其他試劑均為生化試劑。

多功能復合離子注入設備 成都同創(chuàng)材料表面新技術工程中心；超凈工作臺 濟南杰康凈化設備廠；高效液相色譜儀 Agilent公司；HZQ-Q全溫振蕩器、HPS-250生化培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾有限公司；SB-3200DT超聲波清洗機 寧波新芝科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：米粉30 g，葡萄糖20 g，NaNO32 g，蛋白胨15 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO41.5 g，加水至1000 mL，pH自然。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：米粉50 g，NaNO32 g，蛋白胨15 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO42 g，KH2PO41.5 g，加水至1000 mL，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：取46.0 g，加入1000 mL蒸餾水中，115 ℃高壓滅菌 20 min，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 單孢子懸液的制備

紅曲菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對數(shù)期的紅曲菌用生理鹽水沖洗，制得孢子懸液，收集孢子懸液接種到苦蕎培養(yǎng)基(苦蕎8 g+25 mL水)中，培養(yǎng)72 h左右，加入0.9%的生理鹽水制得孢子菌懸液，180 r/min搖床振蕩打散，過濾除去菌絲，調整孢子懸濁液濃度至106個/mL，添加甘油至體積分數(shù)為5%，備用。

1.2.2 N+離子注入誘變

1.2.2.1 離子注入前樣品的制備

取制得的單孢子菌懸液，按照每個培養(yǎng)皿0.5 mL液體菌種進行涂布，然后經無菌風吹干制成菌斑。

1.2.2.2 離子注入劑量的選擇

本試驗選擇幾個不同的離子注入劑量，在鄭州大學離子束誘變育種及生物工程省重點實驗室進行離子注入。N+束能量為30 keV，束流大小為10 Ma，真空度為10-2～10-3Pa，注入劑量分別為1×1015，5×1015，1×1016，5×1016，1×1017N+/cm2，同時設置真空對照和空氣對照，每個處理設3個重復。誘變孢子用1 mL無菌水洗脫，吸取0.1 mL孢子懸液均勻涂抹于PDA平板中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2.3 離子注入最佳劑量的確定

對經不同離子注入劑量處理的平皿菌斑以及對照平皿制取菌懸液進行顯微鏡計數(shù)，同時計算存活率，從而確定最佳的離子注入劑量。

1.2.3 高產Monacolin K菌株初篩

1.2.3.1 構巢曲霉對峙培養(yǎng)

利用Monacolin K能夠抑制構巢曲霉生長的特點，使用一定規(guī)格的打孔器移取相同大小的誘變紅曲霉接種到PDA平板的一側，28 ℃培養(yǎng)5 天，在平板另一側對應位置接種相同大小的構巢曲霉菌落，將平板放于28 ℃培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)幾天后測量構巢曲霉的菌落直徑，篩選Monacolin K高產的菌株。

1.2.3.2 Monacolin K抗性平板篩選

在PDA培養(yǎng)基中加入Monacolin K溶液，使培養(yǎng)基中Monacolin K的濃度分別為100，200，300，400 mg/L，每個濃度下平行設置3個重復，將構巢曲霉對峙培養(yǎng)篩選得到的誘變菌株涂布于抗性平板上，28 ℃培養(yǎng)7 天，觀察菌落生長情況，根據(jù)菌落生長狀況，選取在高濃度Monacolin K平板上存活的誘變菌株進行后續(xù)實驗。

1.2.4 高產Monacolin K菌株復篩

將初篩得到的紅曲霉菌接種到種子培養(yǎng)基，28 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)3 天，根據(jù)5%(ρ)量接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，平行設置3個重復，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，利用高效液相色譜儀HPLC檢測液態(tài)發(fā)酵樣品中Monacolin K含量。

高效液相色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測波長238 nm，流速1.0 mL/min；流動相比例：甲醇∶0.1%磷酸緩沖液(77∶23，V/V)，進樣量10 μL，柱子溫度保持在25 ℃。

酸式標準品溶液的配制：稱Monacolin K(內酯)標準品，以0.2 mol/L氫氧化鈉溶液定容，在50 ℃條件下超聲轉化1 h，放置到溫室后再放置1 h，配制成質量濃度為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg/mL的酸式標準液。

內酯標準溶液的配制：稱取Monacolin K(內酯)標準品溶解于甲醇溶液中，配制成質量濃度為1 μg，10 μg，100 μg，1 mg，10 mg/mL的洛伐他汀閉環(huán)標準溶液。

誘變菌株發(fā)酵液處理方法：吸取250 μL紅曲發(fā)酵液于2 mL EP管中，加入750 μL有機溶劑溶液混勻，50 ℃條件下超聲1 h，12000 r/min離心5 min，離心后用0.22 μm有機微孔濾膜過濾上清液，高效液相色譜儀測定樣品中Monacolin K含量。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性實驗

將復篩得到的高產Monacolin K誘變菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，連續(xù)轉接5代，相同條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，高效液相色譜儀檢測每代產Monacolin K產量，分析誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

發(fā)酵溫度、搖床轉速、接種量、發(fā)酵時間對紅曲霉產Monacolin K的影響。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進行整理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 原始菌株M2產Monacolin K的能力

Monacolin K易溶于有機溶劑，因此分別采用不同濃度的乙醇、甲醇、乙酸乙酯進行提取，按照1.2.4方法處理原始菌株M2發(fā)酵樣品，測定Monacolin K的含量，結果表明：以100%的乙醇和甲醇為提取溶劑時，M2中Monacolin K提取率最高，但是用甲醇提取Monacolin K時，酸型和內酯型Monacolin K不存在相互轉化[16]，因此在實際提取工作中采用甲醇溶液作為Monacolin K的提取溶劑見圖1。

圖1 不同提取溶劑對Monacolin K提取率的影響Fig.1 The effect of different extraction solvent on the extracting rate of Monacolin K

對原始出發(fā)菌株M2進行液態(tài)發(fā)酵，提取M2菌株的發(fā)酵液進行HPLC檢測，根據(jù)標準曲線計算Monacolin K產量為129.87 mg/L。

2.2 多功能復合離子束注入效應

在N+離子注入過程中，隨著誘變劑量的增加，在離子注入劑量為1×1015N+/cm2時，紅曲菌株的存活率僅為18.52%，在5×1015N+/cm2劑量時菌落存活率為25.44%，呈現(xiàn)上升的趨勢，但是在1×1016N+/cm2時菌落存活數(shù)又下降，并且此后隨著離子注入劑量的增加，菌株的存活率一直呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 N+注入對紫色紅曲M2存活率的影響Fig.2 Effect of N+ implantation on survival rate of Monascus purpureus M2

由圖2可知，M2菌株存活率曲線符合“馬鞍型”劑量-效應曲線，在馬鞍型區(qū)域內具有較高的正突變率，可以獲得產量較高的正突變株[17-20]，因此可以確定1×1015～1×1016N+/cm2為該菌株的最佳離子誘變范圍。

2.3 Monacolin K誘變菌株初篩

2.3.1 構巢曲霉對峙培養(yǎng)

由于紅曲霉產生的Monacolin K對構巢曲霉的生長具有抑制作用。因此，構巢曲霉菌落直徑越小的平板上紅曲霉合成Monacolin K的能力越強[21]。因此我們將誘變得到的單菌落與構巢曲霉做對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與原菌M2相比，部分誘變菌株的平板上構巢曲霉對應的直徑相對要小，因此我們挑選在對峙培養(yǎng)過程中構巢曲霉直徑較小的菌株進行后續(xù)實驗，見表1。

表1 部分對峙培養(yǎng)的構巢曲霉直徑Table 1 Partial Aspergillus nidulans diameters of plate confrontation culture mm

2.3.2 Monacolin K抗性平板篩選

菌株生產次級代謝產物的能力是與耐自身代謝產物的能力呈正相關的，因此，我們將篩選到的紅曲誘變菌株全部涂布于Monacolin K濃度梯度抗性平板中，28 ℃培養(yǎng)一定時間后，發(fā)現(xiàn)隨著Monacolin K濃度的提高，紅曲菌的菌落數(shù)逐漸減少，當平板內濃度升高到200 mg/L時，發(fā)現(xiàn)在平板上只有幾個菌落正常生長，分別是1-14，2-2，3-1，3-5，5-4，5-18，在300 mg/L的平板中只有11-13菌落生長，而到400 mg/L時，平板中并沒有紅曲單菌落生長，因此我們認為長勢良好的這7株菌株具有較高的反饋調節(jié)抑制，具備高產Monacolin K的能力，因此將它們進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，HPLC檢測產Monacolin K的能力，見圖3。

圖3 初始菌株M2及7株突變株產Monacolin K能力Fig.3 Monacolin K production of 7 mutants and original strain M2

2.4 遺傳穩(wěn)定性實驗

為了檢測突變株的遺傳穩(wěn)定性，對篩選出的這7株突變株連續(xù)傳代5次，采用HPLC法檢測第5代突變株中Monacolin K含量。

表2 高產Monacolin K遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of Monacolin K production

由表2可知，紅曲霉原菌和突變株經5次傳代培養(yǎng)后，子代相對于第1代產Monacolin K能力均有所下降，但是突變株11-13遺傳性能比較穩(wěn)定，Monacolin K產量相對穩(wěn)定，故選擇該菌株作為后續(xù)研究的菌株。

2.5 單因素發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

不同溫度下，菌絲的生長速度和代謝速度是不一樣的，并且發(fā)酵產物的積累量也不一樣，因此我們設置了不同的發(fā)酵溫度，觀察紅曲11-13中液態(tài)發(fā)酵物中Monacolin K的含量。

圖4 不同溫度對Monacolin K的影響Fig.4 Effects of different temperatures on Monacolin K

由圖4可知，隨著溫度的升高，Monacolin K含量增高，在30 ℃時達到最高值，隨后隨著溫度的升高，發(fā)酵產物的含量也下降。因此選擇發(fā)酵溫度30 ℃進行實驗。

2.5.2 搖床轉速的優(yōu)化

在發(fā)酵溫度恒定的條件下，改變搖床轉速，可以改變溶氧效果。

圖5 不同轉速對Monacolin K的影響Fig.5 Effects of different speed on Monacolin K

由圖5可知，隨著搖床轉速的提高，紅曲菌株11-13的發(fā)酵液中Monacolin K的含量逐漸增加，搖床轉速為200 r/min時,發(fā)酵液的Monacolin K達到最大值，繼續(xù)增加搖床轉速，Monacolin K產量反而降低。因此，選取200 r/min作為最佳搖床發(fā)酵轉速。

2.5.3 接種量的優(yōu)化

接種量的大小與發(fā)酵過程中底物的消耗速率、細胞生長速率有密切的關系，從而影響發(fā)酵時間的長短和目標產物的產量。

圖6 不同接種量對Monacolin K的影響Fig.6 Effects of different inoculum size on Monacolin K

由圖6可知，在發(fā)酵溫度30 ℃和搖床轉速200 r/min的情況下，接種量少于5%時，菌株11-13的發(fā)酵產物中Monacolin K的含量較少；接種量為10%時，Monacolin K達到最高；接種量增加反而不利于Monacolin K的積累。因此，選擇10%為最佳接種量。

2.5.4 發(fā)酵時間的影響

圖7 發(fā)酵時間對Monacolin K的影響Fig.7 Effects of different fermentation time on Monacolin K

由圖7可知，隨著時間的延長，Monacolin K產量越來越多，14天時達到最高。隨著時間的延長，菌株11-13的發(fā)酵液中Monacolin K含量降低，說明營養(yǎng)物質消耗已盡，發(fā)酵結束。因此選擇發(fā)酵周期為14天。

3 討論

本研究采用N+離子注入法對紫紅曲霉M2進行誘變，經過構巢曲霉對峙培養(yǎng)、Monacolin K抗性平板篩選和HPLC檢測得到1株遺傳穩(wěn)定的誘變菌株11-13，該菌株產Monacolin K的能力是原菌株M2的2.3倍。并對部分發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了研究，發(fā)現(xiàn)最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃，轉速200 r/min，接種量10%，發(fā)酵時間14天。

與原始菌株M2的產量相比，N+離子注入法誘變得到的突變株產量雖高，但是真正用于生產，還需要綜合考慮產品品質和經濟效益，并且紫紅曲霉M2次生代謝產物中還包括影響人類健康的有毒物質桔霉素，因此擬在后續(xù)實驗中，從降低有毒物質桔霉素含量、改進液態(tài)發(fā)酵工藝等方面著手，從而篩選出高產量的紅曲誘變菌株，進而推動工業(yè)生產。

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ScreeningofMonascuswithHigh-yieldMonacolinKandOptimizationofLiquid-stateFermentationConditions

LI Ling1, CHEN Kai1, WANG Yi-lian1, ZHANG Wei2, YANG Yu-zhong1, HU Jin-dong1, LI Ji-shun1*

(1.Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Shandong Provincial Key Lab for Applied Microbiology, Ji'nan 250014, China;2.Institute for the Control of Agrochemicals,Ministry of Agriculture, Beijing 100026, China)

In order to improve the yield of Monacolin K,MonascuspurpureusM2 is mutagenized by 30 keV N+ion implantation. The dose is 1×1015, 5×1015, 1×1016, 5×1016, 1×1017N+/cm2respectively Excellent mutant strains are obtained through the screening method of plate confrontation culture ofAspergillusnidulans, Monacolin K resistance and high performance liquid chromatography (HPLC). And the fermentation conditions are optimized by liquid-state fermentation experiments.The results show that the Monacolin K yield of the best mutant 11-13 is 2.3 times higher than initial strain M2.It remains steady after 5 generations of serial cultivation.The optimum liquid-state fermentation conditionsof 11-13 are as follows：the temperature is 30 ℃, the inoculum size is 10%,the rotating speed is 200 r/min, the fermentation time is 14 days.

Monascus；Monacolin K；N+ion implantation；mutation breeding；fermentation conditions

TS261.12

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.019

1000-9973(2017)12-0089-05

2017-06-17 *通訊作者

山東省科學院青年基金項目(2017QN009)資助；山東省重點研發(fā)計劃(2016GNC113009)

李玲(1985-)，女，山東泰安人，助理研究員，博士，研究方向：應用與環(huán)境微生物；

李紀順(1971-)，男，山東沂水人，高級工程師，主要從事應用微生物和耐鹽植物方面的研究。