何曉芬,蔣永亮,葉佳瑜,顏思思,邵曉梅,吳媛媛,杜俊英,陳曉軍,陳利芳,嚴(yán)偉,方劍喬,趙文勝

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低頻電針對SNI神經(jīng)痛大鼠脊髓背角P物質(zhì)表達(dá)的影響

何曉芬1,蔣永亮1,葉佳瑜1,顏思思1,邵曉梅1,吳媛媛1,杜俊英1,陳曉軍1,陳利芳1,嚴(yán)偉2,方劍喬1,趙文勝3

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,杭州 310053;2.浙江省人民醫(yī)院，杭州 310014;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,杭州 310003)

探討低頻電針對神經(jīng)痛大鼠的干預(yù)效應(yīng)及對脊髓背角P物質(zhì)(substance P,SP)的調(diào)節(jié)作用。將SD大鼠隨機(jī)分為正常組(normal)、假手術(shù)組(sham SNI)、手術(shù)組(SNI)和電針組(SNI＋EA),每組8只。采用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)模型建立大鼠神經(jīng)痛模型,2 Hz電針治療選取術(shù)側(cè)足三里、昆侖穴,每日1次,治療14 d。檢測大鼠術(shù)側(cè)后足縮腿閾(paw withdrawal threshold,PWT),觀察大鼠痛覺超敏反應(yīng)。用免疫熒光法檢測術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性表達(dá)。SNI組大鼠術(shù)側(cè)PWT明顯降低(＜0.01),電針能提高SNI神經(jīng)痛大鼠術(shù)側(cè)的PWT(＜0.01)。SNI組大鼠健側(cè)痛閾無顯著變化(＞0.05)。SNI組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP表達(dá)增多(＜0.01),健側(cè)脊髓背角SP陽性表達(dá)增多(＜0.05),電針能降低SNI大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP表達(dá)(＜0.01),電針對健側(cè)脊髓背角SP表達(dá)無顯著改變(＞0.05)。Sham SNI組大鼠術(shù)側(cè)、健側(cè)PWT和術(shù)側(cè)、健側(cè)脊髓背角SP表達(dá)均無顯著變化(＞0.05)。低頻電針能改善大鼠神經(jīng)痛,其機(jī)制可能與其有抑制術(shù)側(cè)脊髓背角SP表達(dá)有關(guān)。

電針;神經(jīng)痛;脊髓背角;P物質(zhì);大鼠

神經(jīng)病理痛,如中風(fēng)后遺痛、皰疹后遺痛、三叉神經(jīng)痛等,是臨床上常見、多發(fā)又難治的慢性疼痛疾病,針灸尤其是電針療法作為治療痛癥的一種常用方法,已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)病理痛的治療,其療效亦十分明確[1-5],然而電針治療神經(jīng)病理痛的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。P物質(zhì)(Substance P,SP)是與傷害性信息傳導(dǎo)密切相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì),存在于背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角[6-8]。已有研究表明,在多種慢性疼痛中[9-10],SP作為疼痛遞質(zhì)通過感覺神經(jīng)傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞,參與疼痛在脊髓中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制[11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),電針可以通過下調(diào)神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)SP的表達(dá)以減輕神經(jīng)痛[12],但對電針能否通過調(diào)控脊髓背角SP表達(dá)以發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。本研究擬建立坐骨神經(jīng)選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)模型,通過觀察電針對SNI神經(jīng)痛大鼠脊髓背角SP陽性表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探討電針鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用清潔級健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠32只,體重(180±20)g,購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(滬)2008-0016],由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水,12 h循環(huán)燈光。

1.2 儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)試劑

足底機(jī)械痛測量儀(意大利UGO BASILE公司)、韓式穴位神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)、0.25 mm×13 mm無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)、恒溫手術(shù)臺(Harvard公司)、冰凍切片機(jī)(美國Thermo公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)、兔抗大鼠SP多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.3 分組與造模

采用完全隨機(jī)法將大鼠隨機(jī)分為4組,即正常組(Normal)、假手術(shù)組(Sham SNI)、手術(shù)組(SNI)、電針組(SNI＋EA),每組8只。采用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷神經(jīng)痛大鼠模型[13]。SD大鼠稱重后,用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉。大鼠俯臥位固定在手術(shù)臺上,右后肢剃毛,碘伏消毒,乙醇脫碘。在大鼠股骨中點(diǎn)下約0.5 cm處,將大鼠皮膚切開約1 cm,鈍性分離臀部肌肉和股二頭肌,暴露坐骨神經(jīng)主干及其分支(脛神經(jīng)、腓腸神經(jīng)和腓總神經(jīng)),用5/0絲線將脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)緊緊結(jié)扎,在結(jié)扎遠(yuǎn)側(cè)端距神經(jīng)干遠(yuǎn)端約2～4 mm處切斷,腓腸神經(jīng)保留完整性。避免過分牽拉及損傷神經(jīng)。然后逐層縫合傷口,并在術(shù)側(cè)大腿肌注4～5單位青霉素以預(yù)防感染。Sham SNI組大鼠僅暴露神經(jīng),不進(jìn)行結(jié)扎與切斷,其余操作同SNI組。Normal組不做任何處理。

1.4 電針干預(yù)

造模1 d后開始電針干預(yù)。電針組選取術(shù)側(cè)足三里、昆侖,采用0.25 mm×13 mm毫針,進(jìn)針后連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀進(jìn)行電刺激,頻率選用2 Hz,電流強(qiáng)度先用1 mA,每10 min遞增1 mA,共治療30 min,每日治療1次,共治療14 d。Normal、Sham SNI、SNI組不進(jìn)行電針干預(yù),僅給予同電針組相同的固定。

1.5 痛閾檢測

采用動態(tài)足底測量儀檢測大鼠雙側(cè)后足縮腿閾(paw withdrawal threshold,PWT),作為大鼠痛覺異常的指標(biāo)。各組大鼠于基礎(chǔ)痛閾測量前,進(jìn)行3 d適應(yīng)性測痛,以減少環(huán)境對實(shí)驗(yàn)大鼠痛閾的影響。測量時將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上透明塑料盒內(nèi),待大鼠安靜后(即停止梳理毛發(fā)和探索活動),將類似Von Frey絲的金屬絲置于大鼠后足足底外側(cè)(腓腸神經(jīng)支配區(qū)域)。啟動機(jī)械泵,刺激力量從0 g開始以2.5 g/s遞增,直至引發(fā)大鼠逃逸反應(yīng)(縮腿),此時電子記錄器記錄的數(shù)值即為大鼠痛閾。設(shè)定最大刺激力量為50 g,以免大鼠足跖損傷。痛閾檢測時間點(diǎn)為造模前(base)、造模后1 d (D1)、電針后14 d(D14)3個時間點(diǎn),檢測所有大鼠術(shù)側(cè)和健側(cè)PWT。連續(xù)測量5次,每次間隔5 min,去最大值和最小值后,取3次縮腿閾的平均值作為一個時間點(diǎn)痛閾值。

1.6 免疫熒光法檢測脊髓背角SP水平

用10%水合氯醛0.35 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉大鼠,開胸暴露心臟,經(jīng)左心室、升主動脈用生理鹽水(4℃預(yù)冷)快速灌注,直至流出液為澄清液體,接著緩慢推注4%多聚甲醛150 mL,隨后以先快后慢的方式滴注4%多聚甲醛500 mL。快速取出大鼠腰段脊髓(即腰膨大),置于4%多聚甲醛溶液中后固定6 h,繼以移入15%、 30% 蔗糖溶液梯度脫水,經(jīng)液氮速凍后,置入﹣80℃冰箱保存。取出大鼠脊髓,用OCT包埋后,固定于冰凍切片機(jī)的凍頭上,以50mm厚度修片至所需組織部位,以30mm切取組織。小心取出切片,TBST漂洗10 min×3次;用10%驢血清(TBST稀釋),37℃孵育1 h,以增加細(xì)胞通透性和封閉非特異性結(jié)合點(diǎn),切勿洗片;加入兔抗大鼠SP多克隆抗體(1:1000),4℃孵育過夜, TBST漂洗10 min×3次;加入Alexa Fluor?488驢抗兔IgG(H＋L)(1:400,用含10%驢血清的TBST稀釋),進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,37℃孵育(避光)1 h,TBST漂洗10 min×5次(避光);將漂洗干凈的切片轉(zhuǎn)移至處理好的載玻片上,擦干水漬,滴加抗熒光淬滅封片液封片;激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝取圖片。選用ImageProPlus6.0病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽性細(xì)胞率。每組選取3只大鼠,每只大鼠取5張不連續(xù)切片,分別記錄大鼠術(shù)側(cè)腰段脊髓背角淺層(Ⅰ～Ⅱ?qū)?內(nèi)磷酸化SP陽性像素點(diǎn)和區(qū)域總像素點(diǎn),并計(jì)算其陽性百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。術(shù)側(cè)、健側(cè)PWT數(shù)據(jù)采用多次重復(fù)測量方差分析方法分析,其余數(shù)據(jù)均采用單因素方差()分析,以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對SNI大鼠術(shù)側(cè)PWTs變化的影響

動態(tài)觀察造模前(base)、造模后1 d和14 d術(shù)側(cè)足跖PWT變化。如表1所示,造模前各組大鼠術(shù)側(cè)足跖基礎(chǔ)(base)PWT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。造模后各時間點(diǎn),SNI組和SNI＋EA組大鼠術(shù)側(cè)足跖PWT顯著降低,明顯低于Normal組和Sham SNI組大鼠(＜0.01)。電針治療1 d、14 d后,SNI＋EA組大鼠術(shù)側(cè)PWT明顯高于SNI組。造模后各時間點(diǎn),Sham SNI組大鼠術(shù)側(cè)足跖PWT與Normal組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。

2.2 電針對SNI大鼠健側(cè)PWT變化的影響

動態(tài)觀察造模前(base)、造模后1 d和14 d健側(cè)足跖痛閾變化。

如表2所示,造模前各時間點(diǎn)各組大鼠健側(cè)足跖PWT差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。

表1 電針對SNI大鼠術(shù)側(cè)PWTs變化的影響 (±s,g)

注:與Normal組比較1)＜0.01;與Sham SNI組比較2)＜0.01;與SNI組比較3)＜0.01

2.3 電針對SNI大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)變化的影響

如表3所示,Normal組和Sham SNI組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)(圖1)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。與Normal組和Sham SNI組比較,SNI組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)明顯升高(＜0.01);與SNI組比較, SNI＋EA組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)明顯下降(＜0.01)。

表2 電針對SNI大鼠健側(cè)PWTs變化的影響 (±s,g)

表3 電針對SNI大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)變化的影響 (±s,%)

注:與Normal組比較1)＜0.01;與Sham SNI組比較2)＜0.01;與SNI組比較3)＜0.01

圖1 為術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)免疫熒光代表圖;

(免疫熒光×100)

2.4 電針對SNI大鼠健側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)的影響

如表4所示,Normal組和Sham SNI組大鼠健側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)(圖2)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。與Normal組和Sham SNI組比較,SNI組大鼠健側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)明顯升高(＜0.05);SNI組和SNI＋EA組大鼠健側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。

表4 電針對SNI大鼠健側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)變化的影響 (±s,%)

注:與Normal組比較1)＜0.05;與Sham SNI組比較2)＜0.05

圖2 為健側(cè)脊髓背角SP陽性細(xì)胞表達(dá)免疫熒光代表圖;

(免疫熒光×100)

3 討論

神經(jīng)病理痛是臨床常見的病癥之一,由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,一直是基礎(chǔ)和臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[14-16]。目前常用的神經(jīng)病理痛模型有脊神經(jīng)選擇結(jié)扎模型[17]、坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型[18]、坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型[19]以及坐骨神經(jīng)選擇性損傷(SNI)模型[13]。SNI模型制作時,選擇性結(jié)扎腓總神經(jīng)及切斷脛神經(jīng)后遠(yuǎn)端,保留腓腸神經(jīng)的完整性,是相對比較新型的神經(jīng)痛制作模型,主要模擬臨床上外周神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)病理痛,具有制作簡單、模型穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)勢[20-22],課題組前期已成功建立SNI模型[23],用于急性和慢性實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)及機(jī)制探討。我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到,造模后SNI模型大鼠健側(cè)機(jī)械痛閾無明顯變化,而模型制作1 d后,SNI模型大鼠術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾明顯降低,一直持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,表明神經(jīng)病理痛模型成功建立。

神經(jīng)病理痛可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“不通則痛”“經(jīng)脈者,所以能決生死,處百病,調(diào)虛實(shí),不可不通”?；凇笆甲忝?wù)?先取足陽明而汗出”理論,故本實(shí)驗(yàn)選取足三里穴。昆侖穴具有通利關(guān)節(jié)、舒經(jīng)活絡(luò)作用[24],故同時選用昆侖穴。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示電針治療可顯著提高SNI大鼠痛閾,與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[23],已有研究證明多次重復(fù)針刺具有累積效應(yīng),其療效隨著治療次數(shù)的增加而明顯增加。而針刺耐受是影響鎮(zhèn)痛效果的重要因素,針刺耐受導(dǎo)致電針隨著治療次數(shù)的增加其鎮(zhèn)痛作用反而降低[25-26],本實(shí)驗(yàn)電針治療14 d痛閾沒有高于電針治療1 d的痛閾,可能由于針刺耐受導(dǎo)致電針隨著治療次數(shù)的增加其鎮(zhèn)痛作用反而降低而致,也有可能是由于SNI神經(jīng)病理痛大鼠疼痛一直在逐漸加重所致。

神經(jīng)肽SP是速激肽家族中重要一員[27-28],廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中[29-31]。脊髓作為傷害性信號向上位腦結(jié)構(gòu)傳遞的中繼站,初級傷害性傳入神經(jīng)終末止于脊髓背角的不同層,并且與不同的二級脊髓神經(jīng)元接觸,從而使脊髓背角成為疼痛信息傳遞和整合的初級中樞,所以本研究選擇大鼠脊髓背角脊髓來作為研究部位。脊髓的SP是公認(rèn)的與傷害性信息傳導(dǎo)密切相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)[30,32],參與多種疼痛過程[33]。研究表明大鼠注射甲醛后發(fā)現(xiàn)脊髓背角Ⅰ、Ⅱ?qū)覵P免疫陽性物表達(dá)明顯增強(qiáng),也有研究表明大鼠左側(cè)后爪足底切口可增加同側(cè)脊髓背角SP免疫反應(yīng)[9],也有研究表明SNL神經(jīng)痛模型大鼠健側(cè)脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞陽性細(xì)胞表達(dá)增多[34]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示SNI模型大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角SP陽性物表達(dá)明顯增多,且主要表達(dá)在脊髓背角淺層,健側(cè)脊髓背角SP陽性物表達(dá)也明顯增多,這可能與病理狀態(tài)下自身代償有關(guān)。電針能顯著降低脊髓背角SP陽性物表達(dá),對健側(cè)脊髓背角上升的SP陽性物表達(dá)雖有下調(diào)作用,但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能與只選取了術(shù)側(cè)的足三里和昆侖穴有關(guān),建議在以后的研究中選用雙側(cè)足三里和昆侖穴對神經(jīng)病理痛進(jìn)行治療。

綜上所述,我們的研究表明,低頻電針能改善神經(jīng)病理痛,其機(jī)制可能與抑制術(shù)側(cè)脊髓背角SP的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)闡明了電針治療神經(jīng)病理痛的部分機(jī)制,有利于電針更廣泛、更有效地運(yùn)用于臨床上神經(jīng)病理痛的治療。

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Effect of Low-frequency Electroacupuncture on Substance P Expression in the Spinal Dorsal Horn in SNI Neuralgia Rats

1,1,1,1,1,1,1,1,1,2,1,3.

1.Z310053,; 2.310014,;310003,

To investigate the intervening effect of low-frequency electroacupuncture on rat neuralgia and its regulating effect on substance P (SP) in the spinal dorsal horn.SD rats were randomized to normal, sham operation (sham SNI), operation (SNI) and electroacupuncture (SNI+EA) groups, 8 rats each. A rat model of neuralgia was made by spared sciatic nerve injury (SNI). Points Zusanli(ST36) and Kunlun(BL60) on the operation side were given 2 Hz electroacupuncture once daily for 14 days. The rat hind paw withdrawal threshold (PWT) was measured on the operation side to observe its pain hypersensitivity. SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the operation side was determined by immunofluorescence.Operative side PWT decreased significantly in the SNI group of rats (＜0.01). Electroacupuncture increased operative side PWT in the SNI neuralgia rats (＜0.01). Pain threshold on the healthy side had no marked change in the SNI group of rats (＞0.05). SP-positive expression in the spinal dorsal horn increased on the operation side (＜0.01) and also on the healthy side (＜0.05) in the SNI group of rats. Electroacupuncture decreased SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the operation side in the SNI rats (＜0.01). Electroacupuncture did not significantly change SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the healthy side (＞0.05). PWT on the operation and healthy sides and SP-positive cell expression in the spinal dorsal horn on the operation and healthy sides had no marked changes in the SNI group of rats (＞0.05).Low-frequency electroacupuncture can relieve rat neuralgia. Its mechanism may be related to it inhibiting SP-positive expression in the spinal dorsal horn on the operation side.

Electroacupuncture; Neuralgia; Spinal dorsal horn; Substance P; Rats

1005-0957(2017)12-1469-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.12.1469

2017-05-20

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY16H270013,LQ17H270003,LY14H270007,LY14H270002);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81303038,81303039,81473772);浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項(xiàng)目(2013ZZ06)

何曉芬(1986—),女,實(shí)驗(yàn)師

方劍喬(1961—),男,教授,博士生導(dǎo)師,Email:fangjianqiao7532@163.com

趙文勝(1970—),男,副教授,碩士生導(dǎo)師,Email:zjmzhaowensheng@163.com