俞遠(yuǎn)林 陳曉鵬 張衛(wèi)東 彭俊璐

·論 著·(臨床研究)

CD133、CXCR4共表達(dá)與膽囊癌轉(zhuǎn)移特性的相關(guān)性研究

俞遠(yuǎn)林 陳曉鵬 張衛(wèi)東 彭俊璐

目的探討CD133、CXCR4共表達(dá)與膽囊癌轉(zhuǎn)移特性之間的關(guān)系。方法培養(yǎng)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞，并經(jīng)免疫磁珠分選法分選得到CXCR4+和CXCR4-亞群膽囊癌GBC-SD細(xì)胞,分為CD133-CXCR4-、CD133-CXCR4+、CD133+CXCR4-及CD133+CXCR4+四組，以Transwell法檢測四組膽囊癌GBC-SD細(xì)胞侵襲能力。Western-blot法檢測CD133+CXCR4+組與CD133+CXCR4-組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子表達(dá)。Western blot法檢測21例膽囊癌原發(fā)灶組織標(biāo)本中CD133與CXCR4蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟侵犯、膽管侵犯及TNM分期之間的關(guān)系。結(jié)果CD133+CXCR4+組平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(32.49±9.45)，顯著高于CD133+CXCR4-組的(16.17±8.55),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。CD133+CXCR4+組N-cadherin蛋白灰度值為(0.8321±0.1259)，顯著高于CD133+CXCR4-組的(0.4572±0.0775)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。CD133+CXCR4+組E-cadherin 蛋白灰度值為(0.4712±0.0736)，顯著低于CD133+CXCR4-組的(0.8439±0.1339)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。CD133+CXCR4+組Snail蛋白相對灰度值為(0.9455±0.1228)，顯著高于CD133+CXCR4-組的(0.3219±0.0934)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。膽囊癌標(biāo)本淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、肝臟侵犯組、膽管侵犯組CXCR4 蛋白表達(dá)值顯著高于對應(yīng)陰性組(P=0.013,P=0.024,P=0.037)，Ⅰ/Ⅱ分期組顯著低于Ⅲ/Ⅳ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CD133蛋白表達(dá)顯著高于對應(yīng)陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)，Ⅰ/Ⅱ分期組顯著低于Ⅲ/Ⅳ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。肝臟侵犯組、膽管侵犯組與相應(yīng)對照組CD133蛋白相對表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.443,P=0.371)。CD133蛋白與CXCR4蛋白表達(dá)存在明顯正相關(guān)(r=0.693，P<0.01)。結(jié)論CD133、CXCR4共表達(dá)預(yù)示膽囊癌具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移特性。

膽囊癌； 侵襲； CD133

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，5年總生存期僅為5%[1]，甚至更低。近來發(fā)現(xiàn)，腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cells,TICs)被認(rèn)為在腫瘤生成、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)過程中起到關(guān)鍵作用[2-7]。Yu等[8]有關(guān)膽囊癌TICs分離的實驗研究提示，CD133+膽囊癌GBC-SD細(xì)胞具有TICs樣特性?；|(zhì)細(xì)胞源性因子-1α/CXC趨化因子受體-4軸(SDF-1α/CXCR4)在多種實體腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[9]。Zhang等[10]研究顯示，CD133與CXCR4聯(lián)合表達(dá)提示結(jié)腸癌具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移特性。本研究旨在探索CD133與CXCR4共表達(dá)與膽囊癌GBC-SD細(xì)胞侵襲能力及膽囊癌臨床病理特征之間的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

1.病例資料和組織樣本 21例膽囊癌原發(fā)灶標(biāo)本取自2014年12月至2016年12月期間皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院普通外科的手術(shù)病人，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為膽囊癌。其中男性16例，女性5例；年齡39～81歲，中位年齡63歲。分期依據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)與國際抗癌聯(lián)盟(UICC)聯(lián)合制定的2010版膽囊癌TNM分期。Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例。5例行腹腔鏡膽囊切除術(shù)，6例行膽囊癌標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù)，6例行擴(kuò)大根治術(shù)，4例行姑息性切除術(shù)。

2.主要實驗試劑 人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供；胎牛血清購自美國Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基購自中國吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CD133鼠抗人單克隆抗體購自德國Miltenyi公司；CD133分選試劑盒與CD133鼠抗人單克隆抗體均購自德國Miltenyi公司；CXCR4兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自美國Jackson公司；ECL發(fā)光液購自美國Thermo公司。

二、實驗方法

1.細(xì)胞培養(yǎng) 膽囊癌GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(分選后細(xì)胞用無血清培養(yǎng))，100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(pH7.2～7.4)中，常規(guī)置于5% CO2飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平均每2～3 d傳代一次。

2.免疫磁珠分選 收集對數(shù)生長期的膽囊癌GBC-SD細(xì)胞，經(jīng)0.25% EDTA-胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個/ml，PBS洗一次再用300 μl Buffer緩沖液重懸，在上述細(xì)胞懸液中加入100 μl CD133 microbeads及100 μl FCR Blocking溶液，充分混勻后避光置于4 ℃冰箱中孵育30 min。用2 ml Buffer緩沖液洗滌上述避光孵育液，離心后留取沉淀，并用500 μl Buffer緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。將上述細(xì)胞懸液加入分離柱，自然流出的細(xì)胞即為CD133-亞群膽囊癌GBC-SD細(xì)胞，而留在柱內(nèi)的細(xì)胞為CD133+亞群膽囊癌GBC-SD細(xì)胞。在磁場外，用分離柱配備的活塞快速將分離柱中以磁性結(jié)合的CD133+亞群膽囊癌GBC-SD細(xì)胞擠出，用2 ml Buffer緩沖液重懸行后續(xù)實驗。用上述同樣的方法繼續(xù)分選得到CXCR4+與CXCR4-亞群膽囊癌GBC-SD細(xì)胞。根據(jù)實驗設(shè)定為四組：CD133+CXCR4+組、CD133+CXCR4-組、CD133-CXCR4+組、CD133-CXCR4-組。

3.Transwell法檢測GBC-SD細(xì)胞侵襲能力 用無血清DMEM培養(yǎng)基按照1∶1比例稀釋后，取100 μl鋪于Transwell上室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中, 等待上室的基質(zhì)膠生長凝結(jié)，收集對數(shù)生長期GBC-SD細(xì)胞，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，取200 μl加入Transwell上室中,調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～5)×105個/孔，下室中加入含有20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室中的基質(zhì)膠及細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min,1%結(jié)晶紫染色30 min, 在高倍鏡下平移非重疊觀察9個視野，計數(shù)其中的穿膜細(xì)胞數(shù)，并計算平均數(shù)，實驗結(jié)果最終以平均穿膜細(xì)胞數(shù)表示。

4.免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測 細(xì)胞及組織標(biāo)本提取蛋白后行Western blot檢測，實驗重復(fù)3次取平均值。CD133/CXCR4蛋白表達(dá)水平以CD133/CXCR4蛋白條帶密度灰度值和條帶面積的乘積與GAPDH蛋白條帶密度灰度值和條帶面積的乘積的比值表示[5]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、CD133-CXCR4-、CD133-CXCR4+、CD133+CXCR4-、CD133+CXCR4+四組細(xì)胞侵襲能力檢測

Transwell法檢測結(jié)果顯示，CD133+CXCR4+組平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(32.49±9.45)，顯著高于CD133+CXCR4-組(16.17±8.55,P=0.02)、CD133-CXCR4+組(14.85±6.41,P=0.03)和CD133-CXCR4-組(5.32±1.75,P=0.004)(圖1)。

圖1 Transwell法檢測四組細(xì)胞侵襲能力

二、CD133+CXCR4+組與CD133+CXCR4-組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白檢測

Western blot檢測結(jié)果顯示，CD133+CXCR4+組N-cadherin蛋白相對灰度值(0.8321±0.1259)顯著高于CD133+CXCR4-組(0.4572±0.0775，P=0.004)。CD133+CXCR4+組E-cadherin蛋白相對灰度值(0.4712±0.0736)顯著低于CD133+CXCR4-組(0.8439±0.1339，P=0.006)。CD133+CXCR4+組Snail蛋白相對灰度值(0.9455±0.1228)顯著高于CD133+CXCR4-組(0.3219±0.0934，P=0.003)。(圖2)

圖2 CD133+CXCR4+組與CD133+CXCR4-組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

三、膽囊癌標(biāo)本CXCR4和CD133 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

膽囊癌標(biāo)本淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、肝臟侵犯組、膽管侵犯組CXCR4 相對蛋白表達(dá)值顯著高于對應(yīng)陰性組(P=0.013,P=0.024,P=0.037)，Ⅰ/Ⅱ分期組顯著低于Ⅲ/Ⅳ分期組(P=0.016)。年齡組、性別組、腫瘤大小組CXCR4 相對蛋白表達(dá)與對應(yīng)陰性組無明顯差異(P=0.339,P=0.571,P=0.476)。膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CD133蛋白相對表達(dá)顯著高于對應(yīng)陰性組(P=0.009)，Ⅰ/Ⅱ分期組顯著低于Ⅲ/Ⅳ分期組(P=0.018)，年齡組、性別組、腫瘤大小組、肝臟侵犯組、膽管侵犯組CD133蛋白相對表達(dá)無明顯差異(P=0.423,P=0.144,P=0.327,P=0.443,P=0.371)。(表1)

四、膽囊癌標(biāo)本CXCR4和CD133蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表1 21例膽囊癌標(biāo)本CD133與CXCR4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Spearman統(tǒng)計分析結(jié)果提示，CXCR4與CD133蛋白表達(dá)存在明顯正相關(guān)(r=0.693，P<0.01)(圖3)。

圖3 膽囊癌原發(fā)灶中CD133蛋白與CXCR4蛋白表達(dá)相關(guān)性

討 論

1997年，Bonnet等[11]在急性骨髓性白血病研究中發(fā)現(xiàn)，只有CD34+CD38-的癌細(xì)胞能形成急性骨髓性白血病的轉(zhuǎn)移灶。研究顯示，這一亞群細(xì)胞與造血干細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特征，由此引出TICs理論。近年來，TICs理論不斷的在白血病[11]、腦腫瘤[12]及乳腺癌[13]等實體腫瘤中得到實驗論證。TICs理論認(rèn)為，從功能和表型上看，腫瘤內(nèi)部實質(zhì)是一種不均一、異質(zhì)性的等級結(jié)構(gòu)，TICs是處于分化起始階段的一小部分腫瘤細(xì)胞，能實現(xiàn)自我更新、無限增殖、多向分化潛能，因而成為惡性腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵所在[2-7]。

CD133是一個五次跨膜的糖蛋白，起初被認(rèn)為是造血干細(xì)胞的標(biāo)志物。隨著TICs的研究深入，CD133更多被證實為一種TICs標(biāo)志物，在包括腦腫瘤[14]、結(jié)腸癌[15]、前列腺癌[16]等多種實體腫瘤中廣泛研究論證。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CD133+亞群膽囊癌GBC-SD細(xì)胞具有一定的促進(jìn)增殖、侵襲、耐藥潛能、自我更新以及體內(nèi)體外致瘤能力等TICs樣特性[8]。SDF-1α/CXCR4軸是一對與細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞遷移密切相關(guān)的信號軸。眾多研究表明，SDF-1α/CXCR4軸在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移啟動過程中至關(guān)重要[9]。有報道稱[10]，在結(jié)腸癌中，CD133、CXCR4共表達(dá)預(yù)示具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移特性。然而，CD133、CXCR4共表達(dá)與膽囊癌的轉(zhuǎn)移特性是否存在內(nèi)在聯(lián)系，是本研究的出發(fā)點。

腫瘤侵襲特性是其轉(zhuǎn)移的必經(jīng)步驟。首先，本研究利用免疫磁珠法成功篩選出CD133+CXCR4+、CD133+CXCR4-、CD133-CXCR4+及CD133-CXCR4-四組膽囊癌細(xì)胞。通過侵襲能力檢測發(fā)現(xiàn)，CD133+CXCR4+亞群細(xì)胞侵襲能力顯著高于其他組，具有較強(qiáng)的侵襲特性。體外實驗中，本研究對50例膽囊癌原發(fā)灶組織標(biāo)本的蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，CXCR4蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、膽管侵犯及肝臟侵犯呈現(xiàn)相對高表達(dá)，且與CD133蛋白表達(dá)呈一定的相關(guān)性。因而CD133、CXCR4共表達(dá)預(yù)示膽囊癌具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移特性。

EMT是指上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變，變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的一個過程[17-20]。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中即伴隨著EMT的發(fā)生，排列緊密的上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檫\動性極強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞，相對更易穿透包繞癌巢周圍的基質(zhì)，從而進(jìn)入血管或淋巴管。研究顯示，CD133+CXCR4+結(jié)腸癌細(xì)胞具備較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，或可稱為結(jié)腸癌TICs，而EMT進(jìn)程是其參與獲得侵襲與轉(zhuǎn)移能力的重要環(huán)節(jié)[10]。而在膽囊癌是否存在類似現(xiàn)象，我們也進(jìn)行了初步探索，以闡述為何CD133、CXCR4共表達(dá)預(yù)示膽囊癌具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移特性。我們發(fā)現(xiàn)，CD133+CXCR4+亞群膽囊癌細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Snail蛋白，而上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)較低，即CD133+CXCR4+亞群膽囊癌細(xì)胞更易發(fā)生EMT。結(jié)合TICs理論與本研究結(jié)果，我們推測在膽囊癌TICs內(nèi)部，SDF-1α/CXCR4信號軸與EMT在啟動膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中存在協(xié)同效應(yīng)，至于其精確的調(diào)控通路仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，CD133、CXCR4共表達(dá)預(yù)示膽囊癌具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移特性。然而，更為深入的機(jī)制以及相關(guān)調(diào)控通路尚有待進(jìn)一步研究。

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Correlationbetweenco-expressionofCD133,CXCR4andmetastasisabilityingallbladdercancer

YuYuanlin,ChenXiaopeng,ZhangWeidong,PengJunlu.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedYijishanHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241001,China

ChenXiaopeng,Email:drcxp@qq.com

ObjectiveTo explore the correlation between co-expression of CD133, CXCR4 and the metastasis ability in gallbladder cancer.MethodsTheinvasive ability in four groups of CD133-CXCR4-,CD133-CXCR4+, CD133+CXCR4-,CD133+CXCR4+wasmesured using Transwell. EMT related factor proteins of CD133+CXCR4-group and CD133+CXCR4+group were detected using Western blot. The relationship between the expression of CD133 and CXCR4 proteinsin 21 cases of primary gallbladder cancer tissue sampleswith lymph node metastasis, liver metastasis or bile duct metastasiswas analyzed by Western blot.ResultsThe number of migrating cells in CD133+CXCR4+group(32.49±9.45) wassignificantly greater than in CD133+CXCR4-group(16.17±8.55,P=0.02). The expression level of N-cadherin protein in CD133+CXCR4+group(0.8321±0.1259) was significantly higher than that in CD133+CXCR4-group (0.4572±0.0775,P=0.004). The expression level of E-cadherin protein in CD133+CXCR4+group(0.4712±0.0736)was significantly lower than that in CD133+CXCR4-group(0.8439±0.1339,P=0.006). The expression level of snail protein in CD133+CXCR4+group(0.9455 0.1228) was significantly higher than in CD133+CXCR4-group (0.3219±0.0934,P=0.003). The expression level of CXCR4 protein in the groups of lymph node metastasis, liver metastasis and bile duct metastasis was significantly higher than in control group (P=0.013,P=0.024,P=0.037, respectively). CXCR4 in stage Ⅰ/Ⅱ (TNM) group was lower than in Ⅲ/Ⅳ group(P=0.016).The expression level of CD133 protein in the group of lymph node metastasis was significantly higher than in control group(P=0.009). The expression of CD133 in stage Ⅰ/Ⅱ (TNM) group was lower than in Ⅲ/Ⅳ group(P=0.018).There was no significant difference between groups of liver metastasis and bile duct metastasis with control group(P=0.443,P=0.371).The expression level of CD133 protein was positively correlated with CXCR4 protein (r=0.693) withthe difference being statistically significant(P<0.01).ConclusionsCo-expression of CD133 and CXCR4 may indicate stronger capability for metastasis in gallbladder cancer.

Gallbladder cancer; Invasion; CD133

R657.3

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2017.06.018

皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金(WF2015F06)

241001 安徽蕪湖，皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院肝膽一科

陳曉鵬，Email：drcxp@qq.com

2017-04-13)