黃 智 連亞軍 武守義

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052

肉毒毒素(botulinum neuro toxin，BoNT)是一種由厭氧梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素蛋白[1]，可阻礙周?chē)窠?jīng)元軸突末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉弛緩性麻痹、腺體分泌減少等，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、美容等行業(yè)[2]。根據(jù)抗原學(xué)分類，BoNT可分為8類，依次命名為BoNT/A-H，并可依據(jù)氨基酸序列進(jìn)一步區(qū)分亞型[3]，如A型肉毒毒素(botulinum toxin A，BoNT/A)可分為7種亞型(A1-A7)，各亞型具有不同的酶活性及毒理學(xué)特征[4-6]。

厭氧梭狀芽孢桿菌合成并釋放無(wú)活性的BoNT前體，BoNT由1條分子質(zhì)量約150 kD的蛋白鏈構(gòu)成，可被自身的蛋白水解酶降解、激活，活化后的BoNT由1條約100 kD的重鏈和1條約為50 kD的輕鏈構(gòu)成，并依靠一個(gè)二硫鍵相連接。重鏈的C末端特異性識(shí)別神經(jīng)元表面神經(jīng)節(jié)苷脂、突觸囊泡蛋白2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體[7-8]，介導(dǎo)輕鏈以囊泡的形式進(jìn)入胞質(zhì)，并參與囊泡的酸化，輕鏈的N末端允許其進(jìn)入胞質(zhì)。輕鏈作為BoNT的活性部分，具有Zn2+依賴的蛋白水解酶活性，可降解1種或2種構(gòu)成可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors，SNAREs)復(fù)合體的蛋白質(zhì)，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

在遞質(zhì)囊泡運(yùn)輸過(guò)程中，SNAREs起到至關(guān)重要的作用[9]。根據(jù)其分布及功能，SNAREs分為靶膜上的SNAREs(target membrane SNAREs，t-SNAREs)和囊泡上的SNAREs(vesicle membrane SNAREs，v-SNAREs)，其中t-SNAREs包括突觸融合蛋白(syntaxin)、突觸囊泡相關(guān)蛋白25(SNAP-25)，v-SNAREs包括突觸小泡締合性膜蛋白(synaptic vesicle-associated membrane protein，VAMP / synaptobrevin)及其相關(guān)蛋白。Synaptobrevin、syntaxin 和SNAP-25聚合成SNAREs復(fù)合體，介導(dǎo)囊泡膜與細(xì)胞膜結(jié)合并形成融合孔，融合孔擴(kuò)張，釋放神經(jīng)遞質(zhì)[10]。BoNT降解囊泡運(yùn)輸過(guò)程中相關(guān)的SNAPEs蛋白，阻礙神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，如BoNT/A、BoNT/C、和BoNT/E水解SNAP-25，BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F，和BoNT/G水解synaptobrevin，BoNT/C水解SNAP-25，及syntaxin[11]，而B(niǎo)oNT/H于2013年被發(fā)現(xiàn)，因其潛在的劇毒性，相關(guān)的研究報(bào)道較少[12]。

在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中，BoNT主要抑制神經(jīng)肌肉接頭、自主神經(jīng)末梢乙酰膽堿遞質(zhì)釋放，作用機(jī)制較為單一，而對(duì)于具有多種神經(jīng)遞質(zhì)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其作用范圍更加廣泛、復(fù)雜，現(xiàn)將其對(duì)在中樞神經(jīng)元的影響概括如下。

1 抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放

既往普遍認(rèn)為BoNT作用于膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元，但實(shí)驗(yàn)表明BoNT可進(jìn)入多種神經(jīng)元，并阻滯非膽堿能神經(jīng)元突觸的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。眾多神經(jīng)元體外培養(yǎng)證實(shí)，BoNT/A可抑制谷氨酸、L-天冬氨酸、5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺、γ-氨基丁酸、腦啡肽、甘氨酸、P物質(zhì)、ATP、降鈣素相關(guān)基因肽[13-19]。

2 抑制神經(jīng)元興奮性

BoNT抑制多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，包括興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、L-天冬氨酸)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(γ-氨基丁酸)，對(duì)神經(jīng)元的興奮性具有一定的影響。Bigalke 等報(bào)道BoNT/A可抑制小鼠脊神經(jīng)元的興奮性和抑制性突觸后電位[20]，隨后證實(shí)BONA/A、BoNT/C、BONE/E抑制自發(fā)性、誘發(fā)的興奮性突觸后電位[21]。研究[18]表明，相較于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，BoNT對(duì)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的抑制作用更顯著 。在大鼠海馬組織中，與谷氨酸能神經(jīng)元相比，γ-氨基丁酸能神經(jīng)元內(nèi)SNAP-25含量較低，對(duì)BoNT-A、BoNT-E的抵抗作用較強(qiáng)，大劑量的BoNT-A才產(chǎn)生抑制作用[22]。

3 抑制Na+通道

SHIN等[23]發(fā)現(xiàn)，BoNT/A抑制河豚毒敏感、不敏感性Na+通道，呈劑量依賴性，且對(duì)中樞性神經(jīng)元的抑制作用強(qiáng)于周?chē)窠?jīng)元細(xì)胞。A2型較A1型抑制作用更強(qiáng)，對(duì)Na+通道的抑制作用強(qiáng)于抗癲癇藥物(苯妥英、拉莫三嗪)，證實(shí)BoNT/A2 可影響海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Na+電流波幅，表現(xiàn)為前期波幅短暫增加，隨后出現(xiàn)持續(xù)8～10 min的波幅降低。作者認(rèn)為前期短暫的波幅增加同BoNT重鏈介導(dǎo)的輕鏈穿過(guò)細(xì)胞膜相關(guān)，進(jìn)而推測(cè)BoNT結(jié)合鈉離子通道的位點(diǎn)位于細(xì)胞膜內(nèi)[23]。

4 逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)胞吐作用

通常認(rèn)為BoNT作用于局部，而忽略了其可擴(kuò)散至遠(yuǎn)端組織。目前研究[24]表明，BoNT具有逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)胞吐作用，可逆行性傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因BoNT/A特異性切割SNAP-25，可將切割后的cSNAP-25(cleaved SNAP-25，cSNAP-25)作為BoNT的標(biāo)志物。ANTONUCCI等[24]在大鼠一側(cè)的海馬區(qū)注射BoNT/A，可在同側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)、對(duì)側(cè)海馬區(qū)探及cSNAP-25，并抑制對(duì)側(cè)海馬的活動(dòng)。在視區(qū)頂蓋、晶須處注射BoNT/A，在視網(wǎng)膜突觸末端、面神經(jīng)核檢測(cè)到cSNAP-25，后續(xù)研究在視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞、感光細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)突觸囊泡數(shù)目異常增多，證實(shí)了BoNT可經(jīng)轉(zhuǎn)胞吐逆行并發(fā)揮作用[25]。Matak等[26]在大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)注射BoNT/A，在脊髓前角膽堿能神經(jīng)元內(nèi)探及cSNAP-25，且該傳導(dǎo)可被秋水仙素抑制。一項(xiàng)在對(duì)腦卒中患者外周肌內(nèi)注射BoNT研究中發(fā)現(xiàn)BoNT/A可通過(guò)軸索運(yùn)輸至脊髓，抑制脊髓回返旁路與任肖細(xì)胞間乙酰膽堿釋放，降低脊髓回返抑制途徑[27]。BoNT逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)及跨突觸傳遞的機(jī)制尚未明確，具體過(guò)程還需進(jìn)一步研究。

5 可逆性損害認(rèn)知、記憶等高級(jí)功能

在動(dòng)物腦組織內(nèi)給予BoNT，可抑制5-羥色胺、多巴胺遞質(zhì)的釋放，與離體神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)果相符[28-29]。在成年大鼠內(nèi)嗅區(qū)皮質(zhì)注射BoNT/B，可出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能損害[30]，另一項(xiàng)研究顯示，在小鼠腦室內(nèi)注射BoNT/A、BoNT/B，小鼠出現(xiàn)一系列癥狀，如立毛、體質(zhì)量降低、體溫下降、眼瞼閉合、反射消失、呼吸困難甚至死亡[31]，而采用亞致死劑量，小鼠出現(xiàn)辨別新事物等行為障礙[32]。COSTANTIN等[33]實(shí)驗(yàn)表明，該認(rèn)知功能損害具有可逆性，將BoNT/B注射至海馬區(qū)域，大鼠出現(xiàn)了為期5周的可逆性的空間學(xué)習(xí)、記憶功能損，且持續(xù)時(shí)間與BoNT/B代謝的時(shí)間相符。盡管該研究表明BoNT對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能可隨BoNT的降解而恢復(fù)，但尚缺乏長(zhǎng)期用藥的研究及對(duì)大鼠行為學(xué)影響的全面評(píng)估，及對(duì)中樞不同神經(jīng)核團(tuán)的影響。

癲癇是多種原因引起的腦部神經(jīng)元高度異常同步化放電所致的臨床綜合征，具有持續(xù)存在的能產(chǎn)生癲癇發(fā)作的腦部持久性改變[34]。癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性與抑制性失衡所致，與興奮性、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、遺傳、炎癥、免疫等有關(guān)[35]。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)BoNT可阻礙多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對(duì)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)抑制作用較強(qiáng)，為治療癲癇提供了理論依據(jù)。

COSTANTIN[33]于2005年報(bào)道在大鼠單側(cè)海馬預(yù)注射BoNT/E，可抑制Ca2+依賴性鉀通道誘發(fā)的谷氨酸釋放、海馬錐體細(xì)胞的尖波電活動(dòng)，顯著抑制海人酸誘發(fā)的局灶性及全面性癲癇發(fā)作，增加電刺激誘發(fā)癲癇發(fā)作的閾值，延遲癲癇的發(fā)生，減少神經(jīng)元凋亡。在海馬組織中，cSNAP-25可存在3周以上，注射后1周行水迷宮訓(xùn)練，BoNT組出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙；而cSNAP-25經(jīng)過(guò)5周后不能檢測(cè)到，此時(shí)BoNT組水迷宮測(cè)試與空白組無(wú)明顯差異，證實(shí)了BoNT/E可抑制癲癇發(fā)作，對(duì)認(rèn)知功能的損害具有可逆性，與經(jīng)典抗癲癇藥物苯妥英鈉對(duì)照中，進(jìn)一步證實(shí)BoNT/E更為有效。

ANTONUCCI等[36]進(jìn)一步研究了BoNT/E對(duì)于慢性癲癇模型的影響，在小鼠海馬注射海人酸誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)3 h后給予海馬區(qū)注射BoNT/E，可延長(zhǎng)慢性癲癇的潛伏期，但治療組和對(duì)照組均出現(xiàn)慢性癲癇，每日的發(fā)作次數(shù)及時(shí)間無(wú)差異。在海人酸注射側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)的元喪失及齒狀回細(xì)胞分散程度降低[37]。該試驗(yàn)揭示了BoNT/E在癲癇形成中的保護(hù)性作用，但對(duì)慢性癲癇的產(chǎn)生無(wú)明顯影響。而另一項(xiàng)研究選取海人酸注射3周后的慢性癲癇模型，給予海馬區(qū)注射同等計(jì)量的BoNT/E，發(fā)現(xiàn)可降低大鼠每日癲癇的發(fā)生次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。

BoNT/A、BoNT/B同樣具有抗癲癇作用，在杏仁核點(diǎn)燃模型中，二者均增加電刺激的閾值，抑制谷氨酸釋放，呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴性，其中BoNT/B可持續(xù)50 d，較BoNT/E明顯延長(zhǎng)[38]。在對(duì)于 BoNT/A的不同亞型研究中，在杏仁核點(diǎn)燃模型中海馬注射等劑量的A1、A2型BoNT，并統(tǒng)計(jì)術(shù)后電刺激的閾值及癲癇發(fā)作狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)BoNT/A2可提高電刺激閾值，降低癇性發(fā)作，而B(niǎo)oNT/A1組較空白組無(wú)明顯差異[39]，可能因A1型擴(kuò)散速度較A2型快，A1型擴(kuò)散范圍較廣，局部不能形成有效濃度，不能抑制局部電刺激誘發(fā)的癲癇發(fā)作。

以上研究均采用顱內(nèi)海馬區(qū)局部注射，操作具有創(chuàng)傷性及感染風(fēng)險(xiǎn)，在實(shí)際操作中具有一定的難度，不利于應(yīng)用到臨床實(shí)踐中，應(yīng)進(jìn)一步探究顱外無(wú)創(chuàng)給藥途徑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻腔給藥可經(jīng)嗅神經(jīng)、三叉神經(jīng)通路傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并具有繞過(guò)血腦屏障、生物利用度高、無(wú)肝臟首過(guò)效應(yīng)等特點(diǎn)[40]，被用于研究帕金森病、腦缺血、阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[41-42]。嗅神經(jīng)可投射至腦的不同區(qū)域，如梨狀皮質(zhì)、杏仁核、下丘腦等[43]，目前實(shí)驗(yàn)證實(shí)鼻腔給予miR-146a mimics可延遲氯化鋰-匹魯卡品癲癇模型的癲癇發(fā)作[44]。因BoNT的逆神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)胞吐作用，利用嗅神經(jīng)傳導(dǎo)通路，可探究鼻腔內(nèi)給藥對(duì)于癲癇發(fā)作的影響。

后續(xù)可進(jìn)一步利用BoNT不同的類型的酶活性及毒理學(xué)特征，如BoNT/A半衰期時(shí)間長(zhǎng)，可能作為潛在的長(zhǎng)效抗癲癇藥物，避免常規(guī)抗癲癇藥物需長(zhǎng)期、規(guī)律服用的弊端；BoNT/E作用時(shí)間短暫，可應(yīng)用于癲癇外科，對(duì)不能明確的手術(shù)切除部位暫行局部注射，有助于進(jìn)一步精確定位。綜上，目前研究表明，BoNT可抑制神經(jīng)元興奮性，減少癲癇的急性期發(fā)作及慢性自發(fā)癲癇發(fā)作，降低神經(jīng)元損傷、腦部異常放電，為癲癇的治療提供了新的途徑，但目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段，還需進(jìn)一步探索。

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