異性骨髓移植后無精癥患者Y染色體的檢測

胡 瑩， 梁先念， 于建紅， 覃凌云， 王玉明

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650101；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院男性科，云南 昆明 650101）

10%～15%的精子缺陷和男性不育是由遺傳因素引起的，其中Y染色體AZF區(qū)微缺失是引起精子缺陷和男性不育的主要遺傳因素之一。外周血染色體核型分析合并Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測對臨床醫(yī)師選擇不同的輔助生殖技術(shù)和避免父代遺傳基因缺陷有著重要的意義。然而，不同性別供者、受者之間進(jìn)行骨髓移植，會(huì)形成穩(wěn)定的嵌合體，染色體相關(guān)檢測結(jié)果表現(xiàn)為供者型。本研究報(bào)道異性骨髓移植后無精癥患者1例，其外周血Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測和染色體核型分析結(jié)果均顯示無Y染色體，但口腔黏膜拭子Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測結(jié)果顯示AZF區(qū)位點(diǎn)均存在。臨床應(yīng)對異性骨髓移植后無精癥患者的外周血Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測結(jié)果加以重視。

1 材料和方法

1.1 研究對象

患者，男，33 歲，因無精癥來昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診。該患者于2000年確診為慢性粒細(xì)胞性白血病。2001年在北京大學(xué)第一醫(yī)院行骨髓干細(xì)胞移植術(shù)，供者為患者姐姐，術(shù)后恢復(fù)良好。2015年2月在昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院行精液常規(guī)檢查，檢查結(jié)果顯示精子總數(shù)為0，且對精液高速離心后沉渣鏡檢也未見精子。睪丸彩色多普勒超聲提示右側(cè)睪丸大小為38 mm×22 mm×16 mm，體積為8.6 cm3；左側(cè)睪丸大小為38 mm×21 mm×15 mm，體積為8.4 cm3。雙側(cè)睪丸體積偏小。

1.2 方法

1.2.1 外周血染色體核型分析 采集該患者外周血0.8 mL，運(yùn)用肝素進(jìn)行抗凝處理，置于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，恒溫37 ℃培養(yǎng)72 h。收獲前1小時(shí)加入秋水仙素，常規(guī)收獲細(xì)胞，制片，G顯帶，分析 3～5個(gè)分裂相，計(jì)數(shù)20個(gè)核型，參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（an International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）（2005）[1]進(jìn)行外周血染色體核型描述。

1.2.2 外周血Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測 采集該患者外周血3.0 mL，運(yùn)用乙二胺四乙酸進(jìn)行抗凝處理，運(yùn)用多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）（北京愛普益生物科技有限公司人Y染色體AZF區(qū)微缺失核酸檢測試劑盒）檢測外周血Y染色體AZF區(qū)的8個(gè)序列標(biāo)記位點(diǎn)（sequence-tagged site，STS）（AZFa區(qū)：sy84、sy86；AZFb區(qū)：sy127、sy134；AZFc區(qū)：sy254、sy255；AZFd區(qū)：sy145、sy152）。設(shè)正常男性為陽性對照，設(shè)正常女性為陰性對照。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃1 min，4個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s，56 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。運(yùn)用2%瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.2.3 口腔黏膜拭子Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測 采集該患者口腔黏膜拭子樣本，1 mL三羥甲基氨基甲烷緩沖液震蕩，高速離心，將所有沉淀富集到離心管中，提取DNA后進(jìn)行口腔黏膜拭子Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測。

1.2.4 血清生殖激素檢測 采用ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)（化學(xué)發(fā)光法）及配套試劑（美國雅培公司）檢測血清泌乳素、卵泡刺激素、黃體生成素、雌二醇、孕酮、睪酮水平。

2 結(jié)果

2.1 外周血染色體核型分析結(jié)果

該患者外周血染色體核型分析結(jié)果為46xx。見圖1。

圖1 外周血染色體核型分析結(jié)果

2.2 外周血Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測結(jié)果

外周血Y染色體AZF區(qū)的8個(gè)STS均缺失，且Y染色體性別決定基因（sex-determining region Y，SRY）無擴(kuò)增曲線。

2.3 口腔黏膜拭子Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測結(jié)果

口腔黏膜拭子Y染色體AZF區(qū)的8個(gè)STS均存在，且SRY均擴(kuò)增到曲線。多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

圖2 Y染色體AZF區(qū)微缺失多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.4 血清生殖激素檢測結(jié)果

該患者卵泡刺激素及孕酮水平均升高。卵泡刺激素水平為15.88 IU/L（參考區(qū)間為0.95～11.8 IU/L）；孕酮水平為0.84 nmol/L（參考區(qū)間為＜0.64 nmol/L）。該患者血清泌乳素水平為169.07 mIU/L（參考區(qū)間為72.66～407.40 mIU/L）；黃體生成素水平為6.23 IU/L（參考區(qū)間為0.57～12.07 IU/L）；雌二醇水平為90.12 pmol/L（參考區(qū)間為40.37～161.48 pmol/L）；睪酮水平為24.66 nmol/L（參考區(qū)間為4.94～32.01 nmol/L）。

3 討論

遺傳學(xué)異常是臨床上導(dǎo)致男性不育的重要因素。隨著生殖醫(yī)學(xué)及男科學(xué)的不斷發(fā)展，很多既往認(rèn)為只能供精輔助生育的患者，可能可以通過睪丸顯微取精術(shù)，行輔助生殖技術(shù)來助孕[2]。因此，遺傳學(xué)檢查對男性生殖疾病診治來說越來越重要，其對指導(dǎo)臨床治療、提高輔助生殖技術(shù)的療效和安全性、開展胚胎植入前遺傳學(xué)診斷等方面都有著重要的意義。

染色體核型分析是最常用的男性生殖遺傳學(xué)檢查，男性染色體核型異常會(huì)導(dǎo)致不育[3]，Y染色體微缺失是導(dǎo)致無精癥和嚴(yán)重少精癥的一個(gè)重要遺傳因素。在無精癥和少精癥患者中，AZF區(qū)微缺失的情況占3%～29%，其發(fā)生率僅次于Klinefelter綜合征[4]。建議對非梗阻性無精癥、嚴(yán)重少精癥患者行Y染色體微缺失檢測[5]。對原因不明的男性不育患者，可選擇行Y染色體微缺失檢測[6-7]。AZF區(qū)微缺失可垂直遺傳，故建議有相關(guān)家族史者進(jìn)行AZF區(qū)微缺失篩查[8]。

骨髓移植是在破壞受者造血系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，輸入供者的骨髓細(xì)胞，使供者細(xì)胞在受者體內(nèi)生長，受者造血系統(tǒng)得以重建。骨髓移植成功與否，與供者細(xì)胞在受者體內(nèi)的植入狀態(tài)，即與供者嵌合狀態(tài)的建立和發(fā)展有關(guān)。當(dāng)供者骨髓細(xì)胞完全占據(jù)受者的骨髓或外周血，即供者細(xì)胞完全植入時(shí)，為完全嵌合狀態(tài)。如果供者為女性，受者為男性，可通過檢測供者的Y染色體，來確定嵌合狀態(tài)。

本研究中患者因無精癥前來就診，并行Y染色體微缺失檢查。外周血Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測結(jié)果顯示SRY無擴(kuò)增，建議作外周血染色體核型分析，結(jié)果為46xx。通過對該患者病史進(jìn)行詳細(xì)詢問，得知患者在十余年前進(jìn)行了異性骨髓移植，可能為移植后嵌合狀態(tài)。故采集患者口腔黏膜拭子樣本進(jìn)行Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測，結(jié)果為AZF區(qū)位點(diǎn)均存在。基本排除該患者無精癥的病因?yàn)閅染色體AZF區(qū)微缺失的可能。無精癥是否和患者行骨髓移植使用大劑量化療藥物有關(guān)，患者雙側(cè)睪丸體積偏小，是否與遺傳性無精癥有關(guān)，均需進(jìn)行下一步檢查才能明確病因。

對于無精癥和嚴(yán)重少精癥的患者，在行輔助生殖技術(shù)治療前，必須進(jìn)行染色體和Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測，以便臨床醫(yī)師進(jìn)行預(yù)后判斷，從而避免缺陷垂直遺傳。本研究結(jié)果提示，臨床醫(yī)師應(yīng)對異性骨髓移植后無精癥患者加以重視，需考慮嵌合狀態(tài)的情況，警惕把外周血染色體檢測結(jié)果錯(cuò)判為受者的結(jié)果。應(yīng)運(yùn)用組織DNA檢測結(jié)果來代表移植前的基因狀態(tài)，如口腔黏膜細(xì)胞、病理切片組織等。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，漱口水樣本可用于受者移植前基因型的確定。本研究未嘗試使用漱口水樣本進(jìn)行檢測。除外周血之外，何種樣本類型適用于Y染色體微缺失檢測，還需增加病例數(shù)后再作進(jìn)一步研究。

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