劉北林+張俁+王利平

[摘要] 目的 研究新疆維吾爾自治區(qū)漢族和維吾爾族人群的絲氨酸蛋白酶抑制劑-2（SERPINE2）rs3795987位點的基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾?。–OPD）之間的相關(guān)性。 方法 本研究采用病例對照研究，選取2015年1～12月新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院呼吸科收治的漢族、維吾爾族COPD患者各88例作為病例組，同期漢族、維吾爾族體檢健康者各100例為對照組。利用聚合酶鏈式反應對入選樣本人群SERPINE2基因rs3795987位點進行基因型測序，并對結(jié)果進行相關(guān)統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 ①新疆漢族與維吾爾族COPD患者的rs3795987位點基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。②新疆漢族與維吾爾族rs3795987位點不同基因型與COPD易感性之間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結(jié)論 新疆地區(qū)漢族和維吾爾族人群的絲氨酸蛋白酶抑制劑-2基因rs3795987位點基因多態(tài)性與COPD的發(fā)生無明顯相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] SERPINE2；慢性阻塞性肺疾??；基因多態(tài)性；病例對照研究

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（b）-0023-04

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the gene polymorphism of serine protease inhibitor -2 （SERPINE2） rs3795987 site and chronic obstructive pulmonary disease （COPD） in Han and Uighur nationality in Xinjiang Uygur Autonomous Region. Methods Case-control studies were used in this study. From January to December in 2015， 88 Han and Uighur nationality COPD patients which were treated in the Department of Respiratory Diseases ofthe Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were separately selected as the COPD group. Meanwhile， 100 Han and Uighur nationality health people were separately selected as the control group. Genotype sequencing of SERPINE2 gene rs3795987 was performed by polymerase chain reaction， and results were analyzed statistically. Results ①There were statistically significant differences in the distribution of rs3795987 site in the patients with COPD in the Han and Uighur nationality in Xinjiang region （P < 0.05）. ②There was no statistically significant difference between different genotypes of rs3795987 sites and COPD susceptibility between the Han and Uighur nationality in Xinjiang region（P > 0.05）. Conclusion The gene polymorphism of SERPINE2 rs3795987 site and the occurrence of COPD in Han and Uighur nationality in Xinjiang region have no significant correlation.

[Key words] SERPINE2； Chronic obstructive pulmonary disease； Gene polymorphism； Case-control study

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是全球第四位的死亡原因，已成為影響人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[1-2]。嚴重的a1-抗胰蛋白酶（a1-AT）缺乏已確定是與COPD相關(guān)的遺傳因素[3]，SERPINE2與a1-AT同屬于SERPINE家族，研究發(fā)現(xiàn)SERPINE2在小鼠肺發(fā)育過程中呈高表達，SERPINE2基因與COPD有一定的相關(guān)性[4-10]；但也有學者發(fā)現(xiàn)SERPINE2基因與慢阻肺COPD的發(fā)生無明顯相關(guān)性[11-12]，故SERPINE2基因在COPD的發(fā)病機制中可能與種族差異性有關(guān)。新疆地區(qū)流行病學調(diào)查顯示COPD患病人群中維吾爾族患病率要高于同區(qū)域其他民族[13-15]，目前有關(guān)SERPINE2基因多態(tài)性與新疆不同民族人群COPD易感性的研究較少，本研究通過檢測新疆漢族、維吾爾族以及健康人群的SERPINE2基因rs3795987位點基因多態(tài)性，探討其與COPD易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1～12月在新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）呼吸科治療的漢族、維吾爾族的COPD患者各88例，COPD診斷以中華醫(yī)學會呼吸病學分會COPD學組修訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[1]為診斷標準。選取同一時期我院漢族、維吾爾族體檢健康者各100例為對照組。病例組和對照組對象均經(jīng)過體格檢查、X線胸片、胸部CT等檢查，除外支氣管哮喘、肺結(jié)核、肺間質(zhì)纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病，并除外各系統(tǒng)腫瘤等疾病。入選對象均簽署知情同意書。endprint

1.2 儀器與試劑

Veriti 96well PCR儀、3730xl測序儀均系美國ABI公司生產(chǎn)；引物、Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、DNA提取采用的SK8224試劑盒等均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.3 基因組DNA的提取

受試者均采取3 mL外周靜脈血，血樣用EDTA抗凝，-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫凑彰绹鳲mega公司E.Z.N.A.SE Blood DNA試劑盒說明書方法提取DNA，將提取后的DNA置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的DAN片段的聚合酶鏈式反應（PCR）

1.4.1 引物的設(shè)計 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，探針由美國ABI公司提供。rs3795987上游引物為：5′-TTGAAGTGCCTTTTGTTAC-3′，下游產(chǎn)物為：5′-TTGAACCCTGGAGTCTAAC-3′，片段長度為194 bp。

1.4.2 目的基因片段PCR擴增 PCR反應體系的總體積為25 μL，基因組DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 10 mmol/L 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，Taq酶5 U/μL 0.2 μL，ddH2O 20 μL。擴增條件：首先在95°C的溫度下預變性3 min，其次在94°C的溫度下變性30 s，退火30 s，退火溫度為58℃，然后在72℃的溫度下延伸30～60 s，一共循環(huán)35次，最后在72℃的溫度下終末修復延伸10 min。

1.5 基因多態(tài)性分析

限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）檢測SERPINE2基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，用PCR儀進行擴增后，取9 μL的擴增產(chǎn)物，放于1.5%TAE瓊脂糖凝膠中進行電泳，紫外透視儀上觀察電泳條帶，判斷基因型。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic逐步回歸以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD組和對照組基本資料比較

漢族兩組研究人群性別、年齡、吸煙指數(shù)（SI）、體重指數(shù)（BMI）、FEV1/FVC、FEV1%比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；維吾爾族兩組研究人群的SI、FEV1/FVC、FEV1%比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1。

為進一步分析COPD的危險因素，將性別、年齡、SI、BMI納入單因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，在漢族人群中，高齡（OR=0.93，95%CI：0.907～0.956）、男性（OR=2.34，95%CI：1.298～4.218）、低BMI（OR=1.15， 95%CI：1.050～1.273）、高SI（OR=0.999，95%CI：0.998～1.000）是COPD的獨立危險因素（P < 0.05）；在維吾爾族人群中，低FEV1%（OR=3.390，95%CI：1.447～7.942）是COPD的獨立危險因素（P < 0.05）。為控制混雜因素對結(jié)果的干擾，將上述因素納入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果表明，高齡（OR=1.07，95%CI：1.044～1.103）、低BMI（OR=0.86，95%CI：0.776～0.948）是漢族人群COPD的獨立危險因素（P < 0.05），低FEV1%（OR=0.28， 95% CI：0.111～0.714）是維吾爾組人群COPD的獨立危險因素（P < 0.05）。

2.2 PCR擴增及基因測序結(jié)果

SERPINE2基因rs3795987位點其存在三種不同的基因型：A/A、A/G、G/G型。見圖1、圖2。

2.3 SERPINE2基因rs3795879位點基因型及等位基因的分布情況

新疆漢族和維吾爾族COPD組和對照組分別進行Hardy-weinberg檢驗，均符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律。

漢族COPD組與對照組、維吾爾族COPD組與對照組人群rs3795879位點不同基因型分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；COPD組中，漢族與維吾爾族的不同基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；對照組中，漢族與維吾爾族不同基因型分布差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

漢族COPD組與對照組、維吾爾族COPD組與對照組人群rs3795879位點等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；COPD組中，漢族與維吾爾族等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；對照組中，漢族與維吾爾族等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表3。

2.4 SERPINE2基因rs3795879位點基因多態(tài)性與COPD易感性分析

漢族、維吾爾族人群中，rs3795879位點不同基因型與COPD易感性的差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表4。

3 討論

COPD發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，不同經(jīng)濟、文化和環(huán)境等因素的影響可能導致不同民族COPD發(fā)病率存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，新疆喀什地區(qū)維吾爾族COPD患病率高于同地區(qū)其他民族，老年維吾爾族COPD的患病率高達22.8%[13-15]，故新疆地區(qū)COPD發(fā)病可能與基因多態(tài)性具有相關(guān)性。

本研究檢測了新疆漢族和維吾爾族人群SERP?INE2基因rs3795879位點的基因型及等位基因。研究結(jié)果表明：新疆漢族和維吾爾族人群SERPINE2基因rs3795879位點的GG基因型最高、AA基因型最低，G等位基因頻率比A等位基因頻率高，但COPD的患病與該位點的基因型分布間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），提示新疆烏魯木齊地區(qū)漢族、維吾爾族SERPI?NE2基因rs3795879位點可能與COPD的易感性無相關(guān)性，與既往研究結(jié)果一致[16-19]。其原因可能是由于受生活環(huán)境和種族差異影響，造成SERPINE2基因多態(tài)性在不同種族間得出不同結(jié)論；另一方面SERPIN?E2可能是一個潛在的易感基因，尚不能確定是一個與COPD顯著相關(guān)的候選基因，一種基因位點檢測尚不能體現(xiàn)其復雜的發(fā)病機制。endprint

本研究對患者基本臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，新疆漢族人群中的男性、吸煙、高BMI值和高齡都是COPD的危險因素，這與其他研究者所做的研究結(jié)果一致[20]，但多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明上述因素都并非COPD發(fā)生的獨立危險因素，考慮吸煙與宿主因素可能存在交互作用，有研究發(fā)現(xiàn)僅10%～20%吸煙者發(fā)展為有癥狀的COPD，提示不同個體對香煙損傷易感性存在差異，與遺傳因素有關(guān)。本研究中SI不是新疆維吾爾族COPD的危險因素，也進一步提示維吾爾族COPD發(fā)病可能與遺傳相關(guān)。

值得注意的是，本次研究的樣本量有限，結(jié)果可能存在偏差，后續(xù)研究可進一步擴大樣本量；其次，本研究未能考慮基因與環(huán)境因素的交互作用，之后可通過干預實驗研究分析；最后，本次研究只檢測了SERP?INE2基因的一個位點，未來可以對SERPINE2基因的其他家系進行研究，通過析因設(shè)計來分析SERPINE2基因多態(tài)性和慢阻肺易感性之間的相關(guān)性?？傊?，在不同種族人群間的差異性及其與慢阻肺的關(guān)聯(lián)性仍值得探討。

[參考文獻]

[1] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南[J].中華內(nèi)科雜志，2002，25（9）：453-460.

[2] 黃克武，王辰.慢性阻塞性肺疾病隊列研究的概況與思考[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2016，39（11）：910-912.

[3] Laurell CB，Eriksson S. The electrophoretic α1-globulin pattern of serum in α1-antitrypsin deficiency [J]. Scand J Clin Lab Invest，1963，15（2）：132-140.

[4] Demeo DL，Mariani TJ，Lange C，et al. The SERPINE2 gene is associated with chronic obstructive pulmonary disease [J]. Am J Hum Genet，2006，78（2）：253-264.

[5] Zhu G，Warren L，Aponte J，et al. The SERPINE2 gene is associated with chronic obstructive pulmonary disease in two large populations [J]. Am J Respir Crit Care Med，2007， 176（2）：167-173.

[6] Castaldi PJ，Hersh CP，Reilly JJ，et al. Genetic associations with hypoxemia and pulmonary arterial pressure in COPD [J]. Chest，2009，135（3）：737-744.

[7] Hirano K，Sakamoto T，Uchida Y，et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-2 gene polymorphisms in chronic obst?ructive pulmonary disease [J]. Eur Respir J，2001，18（5）：748-752.

[8] Silverman EK，Palmer LJ，Mosley JD，et al. Genomewide linkage analysis of quantitative spirometric phenotypes in severe early-onset chronic obstructive pulmonary disease [J]. Am J Hum Genet，2002，70（5）：1229-1239.

[9] Hersh CP，DeMeo DL，Silverman EK. National emphysema treatment trial state of the art： genetics of emphysema [J]. Proc Am Thorac Soc，2008，5（4）：486-493.

[10] Shapiro SD，Goldstein NM，Houghton AMG，et al. Neut?rophil elastase contributes to cigarette smoke-induced emphysema in mice [J]. Am J Pathol，2003，163（6）：2329-2335.

[11] Arja C，Ravuri RR，Pulamaghatta VN，et al. Genetic determinants of chronic obstructive pulmonary disease in South Indian male smokers [J]. PLoS One，2014，9（2）：e89 957.

[12] 陳巖，李玉. SERPINE2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性[J].山東大學學報：醫(yī)學版，2009，47（7）：111-114.

[13] 凌敏，榮艷，胡翠芬，等.新疆阿克蘇農(nóng)村地區(qū)慢性阻塞性肺疾病現(xiàn)況調(diào)查[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32（9）：712-713.

[14] 凌敏，榮艷，茍安栓，等.新疆農(nóng)村地區(qū)慢性阻塞性肺疾病的危險因素調(diào)查[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34（9）：666-668.

[15] 加孜那，托哈依，胡曉婷，等.新疆和田農(nóng)村地區(qū)60歲以上維吾爾族人群慢性阻塞性肺疾病的流行病學調(diào)查[J].新疆醫(yī)科大學學報，2010，33（9）：1017-1020.

[16] 王愛華.SERPINE2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究[D].濟南：山東大學，2012.

[17] 李黎，米熱班·熱夏提，王懷振，等. SERPINE2 基因多態(tài)性與喀什地區(qū)維吾爾族COPD的易感性關(guān)系[J].新疆醫(yī)學，2017，47（1）：15-19.

[18] Foreman MG，DeMeo DL，Hersh CP，et al. Polymorphic variation in surfactant protein B is associated with COPD exacerbations [J]. Eur Respir J，2008，32（4）：938-944.

[19] 鐘麗.中國云南漢族人群中SERPINE2和GSTP1基因多態(tài)與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究[D].昆明：云南大學，2009.

[20] Hogg JC，Chu F，Utokaparch S，et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease [J]. N Engl J Med，2004，350（26）：2645-2653.

（收稿日期：2017-08-31 本文編輯：李岳澤）endprint