梁穎，張毅，李藝，丁瑩，劉賢金

（江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（南京），江蘇南京 210014）

葉酸作為含有蝶酰谷氨酸結(jié)構(gòu)的一類水溶性類維生素，對人體健康具有至關(guān)重要的作用。葉酸與神經(jīng)系統(tǒng)形成密切相關(guān)，孕婦葉酸攝入不足，會直接導(dǎo)致胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷及巨紅細(xì)胞性貧血[1]。普通人群長期處于葉酸缺乏狀態(tài)會增加罹患心血管疾病、結(jié)直腸癌、胰腺癌[2]以及阿茲海默癥[3]的風(fēng)險。我國葉酸缺乏較鋅、鐵、維生素A缺乏更普遍[4]，約有19.6%人群葉酸攝入不足[5]，北方尤其嚴(yán)重，新鮮綠色葉菜供給不足是其部分誘因[6,7]。

人體所需葉酸無法自身合成，必須依賴飲食攝入。盡管合成葉酸膳食補(bǔ)充劑在市場上涌現(xiàn)，但絕大部分人葉酸攝入還是來源食物。葉酸在食物中分布廣泛，小麥胚芽、動物內(nèi)臟、酵母以及葉類蔬菜均含有豐富的葉酸[8]，葉類蔬菜由于在膳食中占據(jù)比例遠(yuǎn)高于其他富含葉酸的食物，因此葉菜被認(rèn)為是人群葉酸攝入主要來源[9]。目前發(fā)現(xiàn)葉酸的存在形式有150種左右，10-甲酰四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、葉酸、四氫葉酸和5-甲酰四氫葉酸等較為常見[10]，其中葉菜中5-甲基四氫葉酸、葉酸占據(jù)較大比例[11,12]。

葉酸并不穩(wěn)定，熱、光和氧均會使葉酸分裂為沒有生物學(xué)功能的碟呤和對氨基苯甲酸[13]，即使葉菜飲食攝入量大依然可能葉酸攝入不足[8]，如何最大程度減少葉菜中葉酸損失是葉菜中葉酸有效利用的重點。烹飪方法對果蔬中葉酸損失有著不同影響，針對葉菜的研究數(shù)據(jù)非常有限，只有菠菜研究相對較多。Holasova等[14]研究了水煮對菠菜及甘藍(lán)中5-甲基四氫葉酸的影響；Bureau等[15]報道了水煮及加壓蒸煮菠菜碎末中總?cè)~酸變化情況；Delchier等[16,17]研究了清洗、水煮、漂燙、蒸制對菠菜中5-甲基四氫葉酸及其衍生物影響，清炒尚未見報道。其他葉菜的相關(guān)報道[14]寥寥無幾。

我國葉菜種類豐富，在消費者飲食中占據(jù)較大比例，且多為烹飪后食用。本試驗擬以我國八種常見葉菜，菠菜、生菜、青菜、油麥菜、小白菜、大白菜、甘藍(lán)和紫甘藍(lán)為對象，研究水煮、清炒、蒸制不同烹飪方法以及貯藏過程中葉酸含量的變化情況，以期獲得八種葉菜中葉酸含量分布及變化規(guī)律，為居民日常膳食中葉酸攝入提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮菠菜、生菜、青菜、油麥菜、小白菜、大白菜、甘藍(lán)和紫甘藍(lán)，購于南京鐘靈街蘇果超市。

5-甲基四氫葉酸（C20H25N7O6，MW459.46，結(jié)構(gòu)式見圖 1（a））、葉酸（C19H19N7O6，MW441.40，結(jié)構(gòu)式見圖1（b），純度≥98%），美國Sigma公司；乙腈、磷酸（色譜純），上海安譜試驗科技有限公司；磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（分析純），南京壽德試驗器材有限公司。

圖1 5-甲基四氫葉酸與葉酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of 5-CH3-H4 folate and folate

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器（DAD）及OpenLAB CDS ChemStation版工作站），美國Agilent公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；氮吹儀，美國Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 葉菜烹飪處理

葉菜清洗切分預(yù)處理：各種葉菜去除不可食用部分，清水洗滌，瀝干。小白菜、大白菜、甘藍(lán)、紫甘藍(lán)切成約3×3 cm小塊。各蔬菜樣品分為四份，其中一份置-20 ℃冰箱中冷凍12 h，然后真空冷凍干燥機(jī)凍干后磨粉，置-20 ℃冰箱中保存待用。另三份樣品分別用于水煮、清炒、蒸制處理，每個處理重復(fù)三次。

水煮處理：1000 mL燒杯中加入500 mL純凈水，加熱至沸，將稱好的葉菜樣品倒入。各種葉菜沸水中處理1～3 min，以葉菜變熟且硬度適宜為準(zhǔn)。處理后樣品瀝去表面水分，迅速降溫至室溫，置-20 ℃冰箱中冷凍12 h，然后凍干磨粉，置-20 ℃冰箱中保存待用；清炒處理：不銹鋼平底鍋中加入2 g食用油，加熱至約170 ℃后，加入葉菜翻炒，各種葉菜炒制時間1～4 min，以葉菜變熟且硬度適宜為準(zhǔn)。處理后迅速降溫至室溫，瀝去水分，拭去表面油跡，其它處理同上；蒸制處理：蒸鍋中加水煮沸，將各葉菜樣品置于玻璃皿中，放入蒸屜，1～4 min后取出，以葉菜變熟且硬度適宜為準(zhǔn)。其它處理同上。

1.3.2 葉菜貯藏處理

各種新鮮葉菜置于塑料保鮮盒內(nèi)，冰箱4 ℃存放6 d，每天取樣，樣品處理同上，測定其5-甲基四氫葉酸及葉酸含量變化。

1.3.3 葉酸測定方法

稱取5 g葉菜樣品粉末置于50 mL離心管，加入25 mL 0.1 M磷酸鹽緩沖液，置于氮吹儀上吹氮15 s，之后放于90 ℃水浴10 min，離心管取出放入冰浴中冷卻后，轉(zhuǎn)速為26900 g高速冷凍離心機(jī)上離心1 min，上清液過無機(jī)濾膜，進(jìn)棕色進(jìn)樣瓶中待測，整個過程盡可能避光操作。

色譜條件：色譜柱 ZORBAX SB-C18（4.6×150 mm，5 μm）；梯度洗脫程序6%乙腈+94%磷酸鹽緩沖液保持5 min，隨后25 min內(nèi)流動相調(diào)整為25%乙腈+75%磷酸鹽緩沖液，保持2 min；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長285 nm；柱溫25 ℃。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)實驗的均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，并進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉菜中5-甲基四氫葉酸及葉酸含量

八種葉菜中5-甲基四氫葉酸及葉酸含量見表1。由表中數(shù)據(jù)可知，葉菜中5-甲基四氫葉酸含量遠(yuǎn)高于葉酸，所占比例89.57%以上。菠菜中5-甲基四氫葉酸含量最高，為75.32 μg/100 g，小白菜和大白菜含量分別為 64.20 μg/100 g、59.35 μg/100 g，其他依次為生菜、紫甘藍(lán)、青菜、甘藍(lán)、油麥菜。菠菜中5-甲基四氫葉酸含量顯著高于小白菜（p＜0.05），小白菜和大白菜中含量差異不顯著（p＞0.05），大白菜中含量顯著高于紫甘藍(lán)（p＜0.05），而紫甘藍(lán)、生菜、甘藍(lán)、青菜和油麥菜中含量差異均不顯著（p＞0.05）。葉酸亦是在菠菜中含量最高，為8.77 μg/100 g，其他依次為生菜、青菜、大白菜、小白菜、紫甘藍(lán)、油麥菜，甘藍(lán)中無葉酸檢出。菠菜中葉酸含量顯著高于生菜（p＜0.05），生菜、青菜、大白菜和小白菜中含量差異不顯著（p＞0.05），小白菜中葉酸顯著高于紫甘藍(lán)（p＜0.05），而紫甘藍(lán)和油麥菜中葉酸差異不顯著（p＞0.05）。

表1 葉菜中5-甲基四氫葉酸及葉酸含量Table 1 Contents of 5-CH3-H4 folate and folate in leafyvegetables

2.2 烹飪方法葉菜中 5-甲基四氫葉酸含量變化

不同烹飪方法對葉菜中5-甲基四氫葉酸含量影響結(jié)果見圖2。烹飪過程中葉菜中5-甲基四氫葉酸有不同程度的損失。水煮過程葉菜中5-甲基四氫葉酸保持率在57.39～72.45%之間，菠菜保持率最高，其次為甘藍(lán)、青菜、紫甘藍(lán)，生菜、小白菜、油麥菜，大白菜保持率最低，水煮均顯著降低了八種葉菜中5-甲基四氫葉酸（p＜0.05）；清炒過程葉菜中5-甲基四氫葉酸保持率在47.60～67.58%之間，大白菜保持率最高，其他依次為菠菜、生菜、紫甘藍(lán)、青菜、小白菜、油麥菜，甘藍(lán)最低，清炒均顯著降低了八種葉菜中5-甲基四氫葉酸（p＜0.05）；蒸制過程中葉菜中5-甲基四氫葉酸保持率在83.47～97.42%之間，其中油麥菜保持率最高，其它依次為甘藍(lán)、菠菜、青菜、小白菜、紫甘藍(lán)、生菜，大白菜最低，蒸制僅顯著降低了生菜、大白菜中5-甲基四氫葉酸含量（p＜0.05），其他葉菜蒸制前后均無顯著差異（p＞0.05）。烹飪方法除對大白菜中5-甲基四氫葉酸含量影響次序為水煮＞清炒＞蒸制，其他葉菜均為清炒＞水煮＞蒸制，蒸制對于保持葉菜中5-甲基四氫葉酸含量效果較好，水煮次之。

圖2 不同烹飪方法葉菜中5-甲基四氫葉酸含量變化Fig.2 Effects of different cooking treatments on 5-CH3-H4 folate content of leafy vegetables

2.3 烹飪方法葉菜中葉酸含量變化

不同烹飪方法對葉菜中5-甲基四氫葉酸含量影響結(jié)果見圖 3。葉菜中葉酸含量較低，各烹飪方法對其影響較大。水煮過程葉菜中葉酸保持率在0～60.66%之間，生菜保持率最高，其次為小白菜、青菜、菠菜、大白菜，油麥菜和紫甘藍(lán)中葉酸無檢出；清炒過程葉菜中葉酸保持率在0～31.36%之間，菠菜保持率最高，其他為生菜和大白菜，青菜、油麥菜、小白菜、紫甘藍(lán)中無葉酸檢出；蒸制過程中葉菜中葉酸保持率在0～100%之間，其中青菜保持率最高，其它依次為菠菜、小白菜、生菜和大白菜，油麥菜和紫甘藍(lán)中無葉酸檢出。除蒸制對青菜中葉酸影響不顯著（p＞0.05）外，其他各烹飪方法均顯著降低了八種葉菜中葉酸含量（p＜0.05）。

圖3 不同烹飪方法葉菜中5-甲基四氫葉酸含量變化Fig.3 Effects of different cooking treatments on folate content of leafy vegetables

2.4 貯藏過程葉菜中 5-甲基四氫葉酸及葉酸含量變化

圖4 貯藏過程葉菜中5-甲基四氫葉酸及葉酸含量變化Fig.4 Effects of storage on 5-CH3-H4folate in leafy vegetables

圖5 貯藏過程葉菜中葉酸含量變化Fig.5 Effects of storage on folate in leafy vegetables

貯藏過程葉菜中5-甲基四氫葉酸及葉酸含量變化見圖4及圖5。隨著貯藏時間延長，5-甲基四氫葉酸和葉酸含量逐漸降低。由圖2可以看出，5-甲基四氫葉酸含量下降曲線基本符合S型曲線，貯藏初期下降緩慢，然后加速，接下來再次進(jìn)入緩慢下降階段。不同葉菜5-甲基四氫葉酸加速下降拐點不同，紫甘藍(lán)貯藏1 d后5-甲基四氫葉酸含量下降即加速，生菜貯藏3 d后下降加速，其他葉菜均為貯藏2 d后5-甲基四氫葉酸含量下降加速。甘藍(lán)中未檢出葉酸，而油麥菜和紫甘藍(lán)中葉酸分別在貯藏1 d、2 d內(nèi)即無檢出，小白菜中葉酸呈穩(wěn)定下降趨勢，第4 d內(nèi)無檢出，菠菜、生菜中葉酸加速下降拐點出現(xiàn)在第2 d，大白菜出現(xiàn)在第3 d。從營養(yǎng)保持角度考慮，葉菜4 ℃貯藏不宜超過2 d。

3 討論與結(jié)論

3.1 葉菜作為居民膳食中葉酸攝入的主要來源，具有非常重要的地位。葉菜自身脆嫩易變質(zhì)，葉酸又不穩(wěn)定，而我國居民傳統(tǒng)葉菜消費均經(jīng)烹飪處理，居民通過葉菜食用攝入葉酸量不僅受各葉菜品種的影響，同樣受烹飪方法及貯藏的影響。本實驗檢測了八種常見葉菜中5-甲基四氫葉酸及葉酸含量及烹飪和貯藏前后其含量變化情況，以期從葉酸保持角度推薦居民葉菜種類、烹飪方法以及貯藏時間的合理選擇。

3.2 目前葉菜中葉酸含量研究較多的有菠菜和生菜，其他葉菜寥寥無幾。Zhang等[18]測定多批次菠菜中5-甲基四氫葉酸均值為84.2 μg/100 g，Hefni等[19]發(fā)現(xiàn)埃及菠菜中四氫葉酸含量為 79 μg/100 g，生菜為 51 μg/100 g，Shohag等[20]對中國常見蔬菜中葉酸組成及含量的研究中顯示5-甲基四氫葉酸在甘藍(lán)、生菜及菠菜中占據(jù)主要比例，菠菜含量最高，為74.33 μg/100 g，其次為生菜和甘藍(lán)，這與本文研究結(jié)果及趨勢基本一致。邵麗華等[21]研究發(fā)現(xiàn)多種蔬菜葉酸含量在0.85～1.96 μg/g范圍內(nèi)，數(shù)值較本文結(jié)果高，究其原因可能是其檢測采用熒光分光光度計，葉酸本身熒光弱，氧化衍生后熒光增強(qiáng)，但氧化劑作用特異性差，從而可能導(dǎo)致所測葉酸量偏高[22]。

3.3 我們居民葉菜消費多經(jīng)過烹飪處理，烹飪過程中不同熱傳遞介質(zhì)，如水、汽和鍋，以及不同傳遞形式包括傳導(dǎo)、對流均會影響葉菜中葉酸含量。Bureau等[15]對熱燙后菠菜碎末經(jīng)烹飪處理后發(fā)現(xiàn)蒸制可以較好保留葉酸總量，這與本實驗結(jié)果一致；而水煮導(dǎo)致葉酸總量94%的損失，遠(yuǎn)高于本文結(jié)果，這可能由于樣品處理不同，菠菜熱燙切碎使細(xì)胞膜破壞，而葉酸水溶性好從而流失嚴(yán)重而導(dǎo)致[23]；Delchier等[16]和Mckillop等[24]研究發(fā)現(xiàn)水煮可保留菠菜中約一半的葉酸總量，蒸制效果優(yōu)于水煮，葉酸總量沒有顯著降低；Fabbrin等[25]在綜合多文獻(xiàn)分析后認(rèn)為蒸制可能是保留蔬菜中葉酸的最佳烹飪方法，由此可佐證本文實驗結(jié)果。關(guān)于清炒對蔬菜中葉酸含量的影響尚未見報道，本試驗結(jié)果認(rèn)為清炒對于保持葉菜中葉酸含量效果最差。

3.4 目前冷凍對菠菜中葉酸影響的報道較多，Czarnowska等[26]研究發(fā)現(xiàn)菠菜經(jīng)冷凍后 5-甲基四氫葉酸含量下降 26.2%，Delchier等[17]和 Phillips等[27]實驗認(rèn)為冷凍不會顯著降低菠菜中總?cè)~酸含量，極有可能是葉菜中5-甲基四氫葉酸相對其他結(jié)構(gòu)葉酸受溫度影響較大。冷凍菠菜在歐美飲食中較為常見，但不符合我國居民消費習(xí)慣。我國居民多采用新鮮葉菜直接或經(jīng)冷藏后烹飪食用，關(guān)于冷藏對葉菜中葉酸含量變化尚未見報道。本實驗結(jié)果認(rèn)為葉菜4 ℃貯藏不宜超過2 d，2 d后葉酸含量下降加劇。

3.5 本研究提供了我國八種常見葉菜中 5-甲基四氫葉酸及葉酸含量，葉菜中5-甲基四氫葉酸含量占比遠(yuǎn)高于葉酸，菠菜中葉酸總量最高，其次為小白菜、大白菜、生菜、紫甘藍(lán)、青菜、甘藍(lán)、油麥菜。烹飪過程中葉菜中5-甲基四氫葉酸和葉酸均有不同程度的損失，綜合分析可認(rèn)為蒸制對于葉菜中葉酸總量保持效果最佳，其次為水煮，清炒效果最差。從葉酸保持角度考慮，葉菜4 ℃貯藏不宜超過2 d。葉菜是日常飲食中葉酸的主要來源，合理貯藏及烹飪可大大降低葉菜中葉酸損失，對于改善我國居民葉酸攝入不足現(xiàn)狀具有重要意義。

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