王 森，孫永剛，李瑞哲，馬志杰，陳生梅，徐驚濤(青海大學(xué) 畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧810016)

牦牛是生活在海拔2 500～5 000 m青藏高原地區(qū)及毗鄰高山亞高山地區(qū)的一種特有畜種，青藏高原牧民賴以生存的主要生活資料和生產(chǎn)資料。牦牛在外形和生理性能上都與其他牛種有所不同，生產(chǎn)性能較低，繁殖季節(jié)明顯，繁殖性能低[1]。對比牦牛和黃牛卵巢發(fā)現(xiàn)，牦牛卵巢的大小、卵泡數(shù)量及卵泡大小均顯著低于黃牛[2]。犏牛是牦牛和普通牛種的雜交后代，其肉質(zhì)鮮嫩，產(chǎn)肉和產(chǎn)奶豐富。當(dāng)?shù)攸S牛和牦?；烊航慌涫莻鹘y(tǒng)的生產(chǎn)犏牛的方法，因個體差異、生活習(xí)性及高寒氣候適應(yīng)性影響，混群交配的效果并不理想。真犏牛為雄性黃牛和雌性牦牛的雜交后代，出生體格大，容易造成難產(chǎn)，公犏牛雄性不育，無法使雜交優(yōu)勢延續(xù)[3]。

孫永剛等[4]利用體外受精技術(shù)繁育犏牛并取得一定的成果，犏牛體外受精的囊胚率可以達到41.23%。自從Johnson等[5]利用流式細胞儀分離家兔精液，并通過輸卵管輸精得到成活后代以來，先后在牛[6]、豬[7]、羊[8]、貓等[9]家畜身上得到應(yīng)用。而犏牛胚胎生產(chǎn)技術(shù)方面的研究較少，性控犏牛胚胎生產(chǎn)技術(shù)至今還沒有相關(guān)研究報道。因此，本研究對性控犏牛胚胎的生產(chǎn)條件進行探索，優(yōu)化性控犏牛胚胎的生產(chǎn)條件，提高性控犏牛胚胎的囊胚率，以期解決青藏高原牧區(qū)犏牛生產(chǎn)的瓶頸，為優(yōu)良犏牛生產(chǎn)、推廣提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 性控精液

性控凍精精液購自上海奶牛育種中心有限公司(凍精編號：XK31108526)。

1.2 主要試劑、操作液、培養(yǎng)液

TCM-199、FBS(胎牛血清)購自Gibco公司，Percoll試劑購自Solarbio公司，其他試劑沒有說明均為Sigma公司。倒置顯微鏡(Olympus IX71)，體視顯微鏡(Olympus SZX16)，CO2培養(yǎng)箱(Heal Force HF90和BINDER)。

1.2.1 體外成熟液配制 PBS：6.66 mg/mL NaCl+0.24 mg/mL KCl+0.168 mg NaHCO3+56 μg/mL NaH2PO4·H2O+0.14%乳酸鈉+2 mM CaCl2·2H2O+0.5 mM MgCl2·6H2O+2.4 mg/mL Hepes+1.5 mg/mL BSA+0.2 mM C3H3NaO3。調(diào)pH7.2～7.4之間，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存。卵母細胞成熟液：TCM-199+10% FBS+0.2 U/mL FSH+0.2 mM C3H3NaO3+0.0037 mg/L β-雌二醇。

1.2.2 洗精液、受精液的配制 基礎(chǔ)BO-working液：0.66 mg/mL NaCl+0.03 mg/mL KCl+0.02 mM CaCl2·2H2O+ 0.005 mM MgCl2·6H2O+0.113 mg/mL NaH2PO4·H2O +0.31g/mL NaHCO3+1.25 mM C3H3NaO3+50 mg/mL慶大霉素+13.9 mM Glucose。精子洗滌液：90%Percoll分離液：90 mL Percoll+10 mL BO-working+0.037 M NaHCO3;45%Percoll分離液：1 mL 90%Percoll+100 mM C3H3NaO3+0.25 g/mL Glucose+1 mL BO-working。精子獲能液：CR1aa+3.1 mg/mL咖啡因。受精液： CR1aa+4 IU/mL肝素鈉。調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4至之間，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存。

1.2.3 胚胎培養(yǎng)液CR1aa的配制 CR1aa：6.7 mg/mL NaCl+0.23 mg /mL KCl+2.2 mg/mL NaHCO3+0.04 mg/mL C3H3NaO3+0.54 mg/mL半乳酸鈣+0.15 mg/mL L-glutamine+0.01%非必需氨基酸+0.02%必需氨基酸。0.3%BSA CR1aa：150 mg BSA+50 mL CR1aa。5%FBS CR1aa：2.5% FBS+47.5 mL CR1aa。以上溶液滴入少許酚紅指示劑，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4之間，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存。所有試劑在使用之前需在細胞培養(yǎng)箱里平衡2 h以上。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵母細胞的體外成熟 牦牛卵巢來源于青海省西寧市屠宰場。屠宰后的牦牛盡快采集卵巢，放置于22～26 ℃的滅菌生理鹽水(含200 IU/mL青霉素和200 IU/mL鏈霉素)的保溫瓶中，4 h內(nèi)帶回實驗室，保持卵巢保存溫度在20 ℃左右，用眼科手術(shù)剪剪去卵巢周圍的附屬組織，用滅菌的生理鹽水清洗卵巢3次，用帶有7號針頭的一次性注射器抽取卵巢表面2～8 mm卵泡內(nèi)卵泡液，放置于滅菌培養(yǎng)皿中，在實體顯微鏡下用撿卵針撿取卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COCs)，選取透明帶完整，周圍的顆粒細胞包裹緊密的COCs，在PBS緩沖液里面清洗2遍，轉(zhuǎn)移到成熟液里清洗一遍后放入成熟液里面，在38.5 ℃、5%的飽和濕度下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 精子的解凍與獲能 從液氮罐中取一支冷凍性控精液，迅速投于38 ℃左右的溫水中，解凍30 s，用75%的酒精棉球擦拭凍精管，將凍精管中的精液加入含有Percoll分離液的離心管中，2 000 rpm/min，20 min棄上清，加入4 mL含有咖啡因的CR1aa液，1 500 rpm/min，5 min，棄上清，留大約有200 μL；取5 μL的精液，加入495 μL受精液混勻，吸取10 μL左右的混合物，滴入血球細胞計數(shù)板中，進行精子計數(shù)。懸浮精子并調(diào)整精子濃度。

1.3.3 卵母細胞體外受精 分別制成50 μL受精微滴，用石蠟油覆蓋。將體外成熟的卵母細胞用吸卵針吸出，放置于含有BSA的CR1aa液中清洗兩遍。每個受精微滴中加入50 μL的精液，放置于飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中受精6～28 h。

1.3.4 受精卵的體外培養(yǎng) 將受精完成的卵母細胞吸出，放在透明質(zhì)酸酶中反復(fù)吹打去除顆粒細胞。在清洗液中清洗2遍，轉(zhuǎn)移到含0.3% BSA的CR1aa微滴中培養(yǎng)，第2 d統(tǒng)計卵裂率。

1.3.5 牦牛卵丘細胞共培養(yǎng) 制作50 μL的5% FBS CR1aa微滴，用石蠟油覆蓋。在飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中平衡2 h以上。將牦牛的卵泡液經(jīng)過離心后，吸取沉淀，用5%FBS CR1aa溶液清洗一遍后，將沉淀懸浮，取50 μL加入到5% FBS CR1aa微滴中培養(yǎng)，每2 d半數(shù)換液。將受精后去除卵丘細胞的受精卵放入卵丘細胞微滴中進行培養(yǎng)，第7～8天統(tǒng)計囊胚率。

1.3.6 牦牛輸卵管上皮細胞共培養(yǎng) 在屠宰場里，選取卵巢上帶有黃體的剛屠宰后牦牛的輸卵管，放入自封帶中以防污染，25 ℃，4 h運回實驗室，用PBS反復(fù)沖洗。用手術(shù)剪將牦牛輸卵管剪下，用蓋玻片從牦牛子宮向卵巢方向刮取輸卵管上皮細胞，用含有10%FBS+TCM-199的溶液離心清洗后，重懸。加入到含有5 mL的10%FBS+TCM-199溶液的滅菌細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2 d。將貼壁的細胞吹打成懸液，加入到培養(yǎng)微滴中，培養(yǎng)2 d。每隔2 d半數(shù)換液。將受精后去除卵丘細胞的受精卵放入輸卵管上皮細胞微滴中培養(yǎng)，第7～8天統(tǒng)計囊胚率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)的形式表示。采用SAS軟件的ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進行分析，P<0.05為差異顯著。每個處理組至少重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 受精時間對性控犏牛胚胎發(fā)育的影響

從表1知，體外受精24 h的卵裂率均高于受精6 h和18 h(P<0.05)。體外受精24 h囊胚率顯著高于受精6 h、18 h和受精28 h(P<0.05)。

2.2 性控精液的濃度對性控犏牛胚胎發(fā)育的影響

由表2知，當(dāng)性控精液的濃度為4×106～6×106個/mL時，其卵裂率顯著高于濃度為0.4×106～0.6×106個/mL和濃度為0.04×106～0.06×106個/mL(P<0.05)。4×106～6×106個/mL和0.4×106～0.6×106個/mL的精液濃度受精后的囊胚率差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于0.04×106～0.06×106個/mL的囊胚率(P<0.05)。

表1 受精時間對生產(chǎn)性控犏牛胚胎的影響Table 1 Effect of fertilization time on efficiency of sexed embryos

注:同列肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著 (P>0.05)。下同。

Note: Values with different superscripts in the same row mean significant difference between the treatments(P<0.05), the same superscripts mean insignificant difference (P>0.05). The same blow.

表2 性控精液的濃度對生產(chǎn)性控犏牛胚胎的影響Table 2 Effect of sperm concentration on efficiency of sexed embryos

2.3 成熟后COCs的卵丘細胞脫除程度對性控犏牛胚胎發(fā)育的影響

成熟后COCs的卵丘細胞脫除程度對生產(chǎn)性控犏牛胚胎(黃牛♂×牦?！?的影響見表3。由表3知，卵丘細胞不脫除的卵裂率和完全脫除組均顯著高于半脫除組(P<0.05)。而不脫除組的囊胚率顯著高于半脫除組和完全脫除組的囊胚率(P<0.05)。

2.4 不同胚胎培養(yǎng)液對性控犏牛胚胎發(fā)育的影響

從表4知，三種培養(yǎng)體系的卵裂率差異不顯著(P<0.05)，輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)的囊胚率和卵丘細胞共培養(yǎng)的囊胚率顯著高于FBS CR1aa培養(yǎng)液(P<0.05)，輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)的孵化囊胚率顯著高于其他兩組(P<0.05)。

表3 成熟后COCs的卵丘細胞脫除程度對生產(chǎn)性控犏牛胚胎的影響Table 3 Effect of the degree of cumulus removal on efficiency of sexed embryos

表4 不同的胚胎培養(yǎng)液對性控犏牛胚胎發(fā)育的影響Table 4 Effect of embryo culture fluid on efficiency of sexed embryos

2.5 胚胎培養(yǎng)環(huán)境對性控犏牛胚胎發(fā)育的影響

牦牛卵母細胞成熟后，對卵丘細胞分別采取卵丘細胞不脫除進行體外受精，性控精液濃度為4×106～6×106個/mL、體外受精24 h，進行卵丘細胞共培養(yǎng)分別放在低氧(5% CO2、5% O2、90% N2)和高氧(5% CO2)的環(huán)境中培養(yǎng)。從表5知，在低氧環(huán)境下胚胎的卵裂率和囊胚率均顯著高于高氧環(huán)境的卵裂率和囊胚率(P<0.05)，但孵化囊胚率差異不顯著(P>0.05)。

表5 胚胎培養(yǎng)環(huán)境對性控犏牛胚胎發(fā)育的影響Table 5 Effect of embryo culture environment on efficiency of sexed embryos %

3 討 論

哺乳動物的卵母細胞是經(jīng)過減數(shù)分裂的單倍體細胞，分化程度高。一般在體外受精過程中，將分離得到的COCs在體外成熟培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)一段時間，觀察出有第一極體排出，判定為成熟。卵母細胞成熟后，外圍顆粒細胞會發(fā)生膨大，通常也將周圍顆粒細胞膨大作為卵母細胞成熟的標(biāo)志[10]。卵母細胞質(zhì)量與成熟的好壞直接關(guān)系著隨后IVF和胚胎發(fā)育的能力。研究發(fā)現(xiàn)，牦牛的卵母細胞能與黃牛精子進行體外受精，但囊胚的發(fā)育率極低[11]。Zi等[12]用黃牛的卵母細胞與牦牛精子進行種間體外受精時發(fā)現(xiàn)，所生產(chǎn)的犏牛胚胎囊胚率比純牦牛囊胚率高，在體外受精水平上表現(xiàn)出了一定的雜種優(yōu)勢。本研究中，牦牛卵母細胞與奶牛性控精子進行種間體外受精時，卵裂率較高，但囊胚率發(fā)育水平較低。性控精液經(jīng)分流處理后，精子會受到物理或化學(xué)損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，用BO液作為基礎(chǔ)受精液，可以在很短的時間內(nèi)完成受精。但Rehman等[13]用SOF液作為受精液時，受精時間延長至18～24 h，可以得到很好的受精效果。Barcelo-Fimbres等[14]發(fā)現(xiàn)，受精18 h的卵裂率和囊胚率均高于4 h，由此說明如果受精時間過短則會導(dǎo)致受精不充分，從而影響體外受精胚胎生產(chǎn)效率。本研究用CR1aa作為受精液，發(fā)現(xiàn)受精24 h的性控犏牛胚胎的卵裂率和囊胚率均顯著高于其他組，受精18 h的性控胚胎卵裂率和囊胚率與受精6 h差異并不顯著。

體外受精過程中，性控精液濃度的大小對性控胚胎的卵裂率和囊胚率有著至關(guān)重要的作用。Lu等[15]表示，較高濃度的性控精子在體外受精過程中能夠提高囊胚率，所以體外受精時需要一定數(shù)量的精子。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，精子濃度過高會引起多精入卵，影響后期胚胎發(fā)育[14]。許保增[11]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛卵母細胞與普通黃牛精子進行種間雜交時，精子濃度為0.4×106～0.6×106個/mL的卵裂率顯著低于精子濃度為4×106～6×106個/mL，而囊胚率差異不顯著，與本研究中性控精液的IVF的結(jié)果相一致。性控精液經(jīng)過了流式分離法，暴露的時間較長，對精子活力有很大的影響，況且市面上性控凍精管比普通凍精的價格貴10～15倍。所以在性控犏牛胚胎生產(chǎn)時，將性控精液的終濃度調(diào)整在0.4×106～0.6×106個/mL也可達到預(yù)期效果。

顆粒細胞是一種黏液狀的細胞外基質(zhì)蛋白，經(jīng)過促性腺激素的刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生。細胞外基質(zhì)一個重要成分是透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)，能促進卵母細胞成熟和受精[16]。吳冬升等[17]研究發(fā)現(xiàn)，體外受精過程中性控精子的活力下降比常規(guī)精子快很多。趙學(xué)明等[18]在研究影響奶牛性控胚胎的因素時，發(fā)現(xiàn)卵丘細胞部分脫除組的卵裂率顯著高于不脫除組和完全脫除組，而囊胚率差異不顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，半脫除組的卵裂率(51.50%)和囊胚率(13.77%)均顯著低于其他對照組。由此說明，在牦牛卵母細胞種間受精過程中，卵丘細胞對精子受精有著吸引和選擇性控精子的作用。

卵泡中卵母細胞和體細胞之間的交流是復(fù)雜的過程，是通過多種信號傳導(dǎo)的[19]。母體內(nèi)輸卵管是精子運動、獲能、受精的主要場所，也是卵母細胞運輸、成熟和早期胚胎發(fā)育的場所[20]。共培養(yǎng)體系能夠提高囊胚發(fā)生率，克服牛受精胚8～16細胞的發(fā)育阻滯，使之能夠發(fā)育成早期囊胚[21]。通常情況下，把囊胚形成率作為胚胎早期發(fā)育能力的一個重要指標(biāo)。孫永剛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛卵母細胞種間雜交產(chǎn)生的受精卵，在后期培養(yǎng)的過程中，卵丘細胞共培養(yǎng)與輸卵管細胞共培養(yǎng)受精卵的卵裂率和囊胚率差異不顯著，但是均顯著高于SOF培養(yǎng)液。本研究發(fā)現(xiàn)在性控犏牛胚胎發(fā)育過程中，卵丘細胞共培養(yǎng)的卵裂率和囊胚率與輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)無顯著性差異，兩者胚胎發(fā)育水平均顯著高于CR1aa培養(yǎng)液，與以上結(jié)果較一致。本研究發(fā)現(xiàn)，輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)的孵化囊胚率較高，性控精子的活力較低，并且在受精過程中活力下降較快，因此采用輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)較適合性控犏牛胚胎的培養(yǎng)。

傳統(tǒng)的單氣培養(yǎng)箱，氧分壓的濃度是20%，而高濃度氧可以增加活性氧的產(chǎn)生，使胚胎引起氧化應(yīng)激，不利于胚胎的生長，這些研究已在牛上得到驗證[22]。Petersen等[23]發(fā)現(xiàn)，通過不同氧濃度下生長的人卵裂胚胎，冷凍解凍后低氧環(huán)境下卵裂胚的囊胚形成率高。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下犏牛胚胎的卵裂率(71.98%)和囊胚率(23.42%)均顯著高于高氧環(huán)境的卵裂率(58.13%)和囊胚率(11.83%)，與以上結(jié)論相一致。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，體外生產(chǎn)性控犏牛胚胎的最佳條件是體外受精24 h，性控精液濃度為0.4×106～0.6×106個/mL，采取卵丘細胞不脫除方法，胚胎培養(yǎng)方式最好采用輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)，胚胎培養(yǎng)環(huán)境采用低氧環(huán)境。

參考文獻:

[1] 中國牦牛學(xué)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1989.

[2] 陳生梅, 孫永剛, 徐驚濤. 牦牛、黃牛卵巢卵泡發(fā)育及卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的比較研究[J]. 家畜生態(tài)報, 2014, 35(7):54-57.

[3] 羅曉林，謝榮濤，徐驚濤，等.青藏高原犏牛生產(chǎn)技術(shù)研究與示范[J].草業(yè)與畜牧，2009，158(1)：1-4.

[4] 孫永剛, 徐驚濤, 才讓東智, 等. 體外受精生產(chǎn)犏牛胚胎與移植試驗研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2013, 44(5):719-726.

[5] JOHNSON L A, FLOOK J P, HAWK H W. Sex preselection in rabbits: live births from X and Y sperm separated by DNA and cell sorting[J]. Biology of Reproduction, 1989, 41(2):199-203.

[6] GRAN D G, JOHNSON L A, MILLER N G, et al. Production of bovine calves following separation of X- and Y-chromosome bearing sperm and in vitro fertilisation [J]. Vet Rec Jan, 1993, 132(2):40-41.

[7] RATH D, JOHNSON L A, DOBRINSKY J R, et al. Production of piglets preselected for sex following in vitro fertilization with X and Y chromosome-bearing spermatozoa sorted by flow cytometry [J]. Theriogenology, 1997, 47(4):795-800.

[8] EVANS G, HOLLINSHEDA F K,MAXWELL W M, et al. Preservation and artificial insemination of sexed senmen in sheep[J]. Reprod Fertil Dev, 2004, 16(4):455-464.

[9] SPINACI M, MERLO B, ZANNONI A, et al. In vitro production of cat blastocysts of predetermined sex using flow cytometrically sorted semen[J]. Theriogenology, 2007, 67(4):872-877.

[10] FAIR T, HYTTE P, GREVE T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity[J]. Mol Reprod Dev, 1995, 42:437-442.

[11] 許保增. 牦牛種間雜交早期胚胎體外發(fā)育的研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2006.

[12] ZI X D,YIN R H,CHEN S W, et al. Developmental competence of embryos derived from reciprocal in vitro fertilization between yak(Bosgrunniens) or cattle(Bostaurus)[J]. J R epeod Dev, 2009, 55(5):480-483.

[13] REHMAN N, COLLINS A R, SUH T K, et al. Effect of sperm exposure time on in vitro fertilization and embryo development of bovine oocytes matured in vitro[J]. Theriogenology, 1994, 41 (7):1 447-1 452.

[14] BARCELO-FIMBRES M, CAMPOS-CHILLON L F, G S Jr. In vitro fertilization using non-sexed and sexed bovine sperm:sperm concentration,sorter pressure,and bull effects[J]. Reproduction in Domestic Animals, 2011, 46(3): 495-502.

[15] LU K H, SEIDEL G E Jr. Effects of heparin and sperm concentration on cleavage and blastocyst development rates of bovine oocytes inseminated with flow cytometrically-sorted sperm[J]. Theriogenology, 2004, 62(5): 819-830.

[16] MAREI W F, GHAFARI F, FOULADI-NASHTA A A. Role of hyaluronic acid in maturation and further early embryo development of bovine oocytes[J]. Theriogenology, 2012, 78:670-677.

[17] 吳冬生, 劉敬浩, 孫偉, 等. 不同種公牛X/Y精子分離效果及對體外受精能力的影響[J]. 中國奶牛, 2009(4):11-15.

[18] 趙學(xué)明, 杜衛(wèi)華, 郝海生, 等. 影響體外受精生產(chǎn)奶牛性控胚胎的因素[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2011, 19(5):843-848.

[19] ZUCCOTTI M, MERICO V, CECCONI S, et al. Whatdoes it take to make a developmentally competent mammalian egg?[J]. Hum Reprod Update, 2011, 17:525-540.

[20] NICOLAS M O, JUDITH B R. Mammalian embryoco-culture:Trials and tribulations of amis understood method[J]. Theriogenology, 2001, 67:441-458.

[21] MERTON J S,HARING R M,STAP J,et al. Effect of flow cutometrically sorted frozen/thawed semen on success rate of in vitro bovine embryo production. Theriogenology, 1997, 47(1):295-295.

[22] RHO G J, S B, KIM D S, et al. Influence of in vitro oxygen concentration on preimplantation embryo development,gene expression and production of Hanwoo calves following embryo transfer[J]. MolReprod Dev, 2007, 74(4):486-496.

[23] PETERSEN A, MIKKELSEN A L, LINDENBERG S. The impact of oxygen tension on developmental competence of post-thaw human embryos[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2005, 84(12):1 181-1 184.