祖立闖，薛凌壯，王 艷，苗立中*(. 山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600； . 山東省臨清市畜牧獸醫(yī)局，山東 臨清 5600； . 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 56600)

雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由皰疹病毒科(Herpesviridae)α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)的雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)引起雞的一種急性呼吸道傳染病，其特征表現(xiàn)為呼吸困難、喉部和氣管黏膜腫脹、咳嗽及咳出含有血液的滲出物[1-2]。ILTV只能水平傳播，病毒可以潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)等部位使病雞終身帶毒，病雞和帶毒雞是主要傳染源，主要通過氣管黏膜和眼結(jié)膜途徑感染[3]。近年來，隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的規(guī)?；焖侔l(fā)展，ILT呈現(xiàn)出“老病新發(fā)”、以“非典型”和“溫和型”癥狀為主的流行新特征[4-5]，給我國雞病的臨床診斷增加了難度，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2017年1～3月，山東蛋雞養(yǎng)殖場發(fā)生了ILTV感染病例，通過對病死雞的臨床癥狀觀察，結(jié)合病理剖檢和實驗室診斷，最終才對該病例進(jìn)行了確診，現(xiàn)將整個診療過程介紹如下，為相同疾病的診治提供參考。

1 發(fā)病情況

2017年1月26日，山東省臨清市某雞場一棟5 000只330日齡海蘭灰雞群(A雞群)出現(xiàn)個別雞只單側(cè)眼流淚、喘鳴、怪叫等癥狀，精神萎靡、飲食減少、伸頸張口呼吸，每天死亡3～5只；到29日大群發(fā)病，咳嗽加重、張口喘吸、甩血痰，產(chǎn)蛋量減少、采食量驟減、死亡增加至30只；同時，相鄰的7 300只210日齡京粉雞群(B雞群)也出現(xiàn)相似癥狀，因春節(jié)原因，拖到1月30日才來就診。經(jīng)詢問，該場進(jìn)行了新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎等疫苗的免疫接種，但從未進(jìn)行過ILT疫苗的免疫接種，遂按傳染性喉氣管炎病投藥5 d，但未見療效，死亡增至100只左右，懷疑有新城疫、禽流感等疾病混合感染，2月5日，送檢病重雞至實驗室檢驗。

2 臨床癥狀

A雞群發(fā)病蛋雞大棚飼養(yǎng)，通風(fēng)不良，走進(jìn)雞舍明顯感覺到氨氣味、腥臭味；雞群精神沉郁，飲食減少，由正常時的600 kg/d減少至400 kg/d，拉白稀糞，個別綠糞；部分雞只雞冠發(fā)紺，張口呼吸，呼嚕音，咳嗽，咳帶血黏液；少部分雞只腫眼流淚，流涕，無法飲食，迅速消瘦；產(chǎn)蛋由發(fā)病之前的93 %左右降至最低66 %左右，蛋殼顏色變淺，但畸形蛋、沙皮蛋不多；到2月10日痊愈，最后因呼吸困難、消瘦、窒息至死亡約1 600只雞。B雞群癥狀大同小異，但總體較輕，到2月8日痊愈時共死亡700只左右。

3 病理變化

A雞群解剖10只病死雞，主要病變?nèi)缦拢簹夤軡{膜外觀不透明，色澤不均，出血斑6只；氣管黏膜針尖狀皰疹7只；氣管有血色黏痰、干酪物6只；肺臟出血、肺支氣管血栓、9只；肝臟色澤發(fā)暗、發(fā)黃、有出血點6只；腺胃黏膜水腫、出血點7只；肌胃內(nèi)容物如黑焦油狀2只，肌胃角質(zhì)膜糜爛、易脫落1只，肌胃角質(zhì)膜條紋狀潰瘍、米粒樣腫脹甚至潰瘍5只；腸道黏膜出血斑點5只，淋巴叢腫脹4只；卵泡出血、變形3只。B雞群解剖5只病死雞，主要病變有：氣管漿膜外觀色澤斑駁4只；氣管黏膜針尖皰疹5只；血色黏液、條狀黏痰3只；肺出血5只；其他器官如肝臟、脾臟、胃、腸道、卵巢和輸卵管未見異常。

4 細(xì)菌觀察與分離培養(yǎng)

將無菌采集的A雞群和B雞群病死雞喉頭、氣管等組織樣品涂片、革蘭氏染色、鏡檢，均未見任何細(xì)菌。將無菌采集的A雞群和B雞群病死雞喉頭、氣管等組織樣品分別接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、厭氧肉肝湯中進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，均未見任何細(xì)菌生長。

5 病毒PCR檢測與分離鑒定

5.1 病料樣品PCR檢測

分別設(shè)計合成針對雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、H9亞型禽流感病毒(AIV-H9)、I亞群禽腺病毒(Fav-I)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)、禽呼腸孤病毒(ARV)特異性檢測引物(詳見表1)。利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(美國AXYGEN公司產(chǎn)品)分別提取A雞群和B雞群臨床病料樣品的病毒基因組DNA/RNA。分別利用以上7對特異性檢測引物對病毒基因組DNA/RNA進(jìn)行PCR/RT-PCR檢測(詳見表1)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，只有ILTV檢測引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在位于約427 bp處均具有特異性條帶(如圖1所示)，與預(yù)期大小相符。

表1 引物與PCR擴(kuò)增信息表Table 1 Information of primers and PCR amplification

5.2 病毒分離與鑒定

無菌采集病死雞的喉頭、氣管等組織，將其與3倍體積滅菌生理鹽水混合、碾磨，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后，經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚(購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司)10枚，0.2 mL/胚，37 ℃孵育至5 d，經(jīng)盲傳3代后，剖檢雞胚可見胚體全身具有出血點、絨毛尿囊膜增厚、絨毛尿囊膜表面具有大量白色痘斑等特征性病變，無菌收取雞胚的尿囊液和絨毛尿囊膜。按照5.1的方法分別對A雞群和B雞群的分離毒株進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示只有ILTV引物擴(kuò)增為陽性，其余引物擴(kuò)增均為陰性。

6 綜合診斷結(jié)果

綜合發(fā)病情況、臨床特征、病理變化等臨床診斷以及細(xì)菌觀察與分離培養(yǎng)、病毒PCR檢測與分離鑒定等實驗室診斷結(jié)果，綜合確診此次疫病為ILT。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果M. DL-2 000 Marker；1. A雞群ILTV；2. B雞群ILTV；3. ILTV標(biāo)準(zhǔn)毒株對照；4. ILTV陰性對照；5. A雞群NDV；6. B雞群NDV；7. NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株對照；8. NDV陰性對照；9. A雞群IBV；10. B雞群IBV；11. IBV標(biāo)準(zhǔn)毒株對照；12. IBV陰性對照；13. A雞群AIV-H9；14. B雞群AIV-H9；15. AIV-H9標(biāo)準(zhǔn)毒株對照；16. AIV-H9陰性對照；17. A雞群FAV-I；18. B雞群FAV-I；19. FAV-I標(biāo)準(zhǔn)毒株對照；20. FAV-I陰性對照；21. A雞群ARV；22. B雞群ARV；23.ARV標(biāo)準(zhǔn)毒株對照；24. ARV陰性對照；25. A雞群REV；26. B雞群REV；27. REV標(biāo)準(zhǔn)毒株對照；28. REV陰性對照.Fig.1 Results of PCR amplificationM. DL-2 000 Marker；1. A chicken flock ILTV；2. B chicken flock ILTV；3. ILTV standard strain control；4. ILTV negative control；5. A chicken flock NDV；6. B chicken flock NDV；7. NDV standard strain control；8. NDV negative control；9. A chicken flock IBV；10. B chicken flock IBV；11. IBV standard strain control；12. IBV negative control；13. A chicken flock AIV-H9；14. B chicken flock AIV-H9；15. AIV-H9 standard strain control；16. AIV-H9 negative control；17. A chicken flock FAV-I；18. B chicken flock FAV-I；19. FAV-I standard strain control；20. FAV-I negative control；21. A chicken flock ARV；22. B chicken flock ARV；23.ARV standard strain control；24. ARV negative control；25. A chicken flock REV；26. B chicken flock REV；27. REV standard strain control；28. REV negative control

7 治療與預(yù)防方案

A雞群因就診時發(fā)病率較高，未敢緊急免疫，只采取了清肺平喘、止咳化痰、防繼發(fā)感染等保守治療。1月30日至2月4日飲服麻杏石甘湯、薄荷桉葉油及強(qiáng)力霉素，效果不理想；2月5日至2月10日，考慮到部分雞只有腺胃炎、肌胃炎、肝炎的癥狀，在原方基礎(chǔ)上又加上轉(zhuǎn)移因子、葡萄糖氧化酶和膽汁酸方才治愈。

B雞群因雞群發(fā)病晚、發(fā)病率低、癥狀輕，遂采取緊急免疫，1月30日，利用轉(zhuǎn)移因子稀釋國產(chǎn)ILT活疫苗，以1.5羽份/只的劑量點眼接種，同時飲服麻杏石甘湯、薄荷桉葉油和強(qiáng)力霉素，前4 d病情加重，之后逐漸好轉(zhuǎn)，2月8日完全痊愈。

1月31日，對未發(fā)病的9 200只青年雞群實施緊急免疫，轉(zhuǎn)移因子稀釋ILT活疫苗，以1.2羽份/只的劑量點眼接種，除個別雞出現(xiàn)免疫反應(yīng)外，大群未發(fā)病。

8 討 論

近年來ILT弱毒疫苗已在我國部分地區(qū)開始廣泛使用，但由于ILT弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險，且弱毒疫苗株也能引起雞群的潛伏感染，從而導(dǎo)致免疫雞群和非免疫雞群同樣存在ILTV感染隱患。目前雖然不能確定“非典型”和“溫和型”ILT病例是否由疫苗株的毒力返強(qiáng)所致[6]，但“非典型”和“溫和型”病例給ILT的診斷與防治確實增加了極大困難，尤其是“非典型”和“溫和型”ILT病例的臨床特征與傳染性支氣管炎、新城疫、禽流感等呼吸道疾病均極其相似，均表現(xiàn)為氣喘、呼吸困難、咳嗽、啰音等，僅通過臨床特征難以進(jìn)行鑒別診斷，為避免誤診及漏診的發(fā)生，需借助實驗室方法進(jìn)行確診。ILTV實驗室診斷方法主要有病毒分離、血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，其中血清學(xué)方法檢測ILTV的潛伏感染具有一定的滯后性，因ILTV可在雞胚絨毛尿囊膜上形成明顯的灰白色壞死灶或痘斑，可通過雞胚絨毛尿囊膜接種途徑分離病毒即可作出實驗室診斷，而PCR方法作為常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，具有操作簡單、特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點，能夠檢測處于免疫耐受狀態(tài)機(jī)體中的ILTV，可作為ILTV潛伏感染的實驗室檢測手段。本病例中采用PCR檢測和病毒分離2種診斷方法綜合確診為ILTV感染，使診斷結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。

ILT是近幾年老病新發(fā)疾病，結(jié)合目前我國養(yǎng)禽水平和生物安全現(xiàn)狀，疫苗免疫接種和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理仍是防控ILT的主要措施，養(yǎng)殖單位應(yīng)根據(jù)自身情況選擇合適的疫苗和免疫程序，確保雞群具有一定的保護(hù)力。同時在日常養(yǎng)殖中應(yīng)定期消毒，盡量采用全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式，雞舍要注意通風(fēng)換氣，保持舍內(nèi)空氣清新，無有害氣體和灰塵，嚴(yán)謹(jǐn)飼喂發(fā)霉、變質(zhì)飼料，使雞群在良好、舒適的飼養(yǎng)環(huán)境中處于最佳的生長發(fā)育狀態(tài)，可有效預(yù)防ILTV的感染。

針對ILT發(fā)病雞群的治療，緊急免疫仍然是最有效的措施，但是在實施之前必須做好鑒別診斷：有無低致病禽流感、新城疫、腺病毒等常發(fā)病毒病的混合感染，是否有白色念珠菌感染(嗉囊炎)、霉菌感染(肺、氣囊結(jié)節(jié)、肌胃炎)、霉菌毒素感染(腺胃炎、肝炎)等引起的亞健康或免疫抑制，支原體、大腸桿菌、鏈球菌等條件性致病菌感染是否嚴(yán)重；臨床診斷時至少解剖5只發(fā)病最早的雞只，仔細(xì)剖檢甄別，如有上述任何一種情況存在，寧可采取保守治療措施，不可盲目緊急免疫，否則可能會造成巨大損失。本病例中的老雞群死亡率達(dá)到30 %，與霉菌和霉菌毒素感染不無關(guān)系。筆者親歷9 500只320日齡雞群，呼吸道病剛剛?cè)?天，又發(fā)生ILT，鄉(xiāng)村獸醫(yī)建議緊急接種進(jìn)口ILT疫苗，結(jié)果導(dǎo)致3 000多只雞死亡，不得已全群淘汰，損失慘重，這可能與低致病型禽流感有關(guān)。因此，望廣大同仁臨診時要慎之又慎，不能確診的要及時送檢化驗，爭取最佳治療時機(jī)。

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