劉 洋 董 平 郗 政 鄧志會 沈洪濤 張 彥 楊普程

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

骨肉瘤(OS)是來源于間葉組織常見原發(fā)惡性腫瘤，OS在每個年齡段均有發(fā)病，超過3/4患者為青少年，約1/4為老年患者，且男性多于女性〔1〕。OS容易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，5年生存率較低，約為20%。臨床的主要治療為手術(shù)聯(lián)合輔助化療，但療效不甚明顯，OS生存率提高到不足50%〔2〕。OS病變復雜，尚無一個完整體系概括，但病變多在癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和自噬等方面，報道顯示，miR-195屬于微小RNA(miR)-15/16/195家族，在肝癌、結(jié)腸癌和非小細胞等多種惡性腫瘤中異常表達，參與癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移〔3〕；核糖體蛋白L34是核糖體蛋白 L34E家族成員，參與胃癌等惡性腫瘤細胞的增殖和抗凋亡過程〔4〕；自噬參與腫瘤細胞凋亡、耐藥及腫瘤干細胞分化增殖的調(diào)節(jié)，Beclin1作為重要的自噬相關(guān)因子，在自噬體形成過程扮演重要角色〔5〕。miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1是惡性腫瘤病變中研究較多的標記物。本研究擬分析人OS miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 2010年4月至2012年6月齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院確診為OS的患者56例，年齡60～72歲。病變部位為股骨20例、肱骨15例、脛骨15例和腓骨6例。均接受常規(guī)化療聯(lián)合手術(shù)，手術(shù)為單純腫瘤切除術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)，手術(shù)前后均接受常規(guī)化療。選擇同期骨軟骨瘤患者35例，兩組一般臨床資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般情況比較

1.2排除標準 術(shù)前接受輔助治療；診斷時已出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移；預計存活時間≤6個月；存在精神障礙，不配合研究或資料不完整者。

1.3免疫組織化學染色檢測miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化，枸櫞酸緩沖液熱修復抗原，冷卻至室溫以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，滴加 3%過氧化氫行過氧化物酶阻斷，PBS沖洗，滴加山羊血清封閉，去除封閉液，滴加一抗鼠抗人miR-195(1∶100)、核糖體蛋白L34(1∶20 )和兔抗人Beclin1(1∶200)，4℃孵育過夜，37℃復溫45 min，PBS沖洗，分別滴加抗鼠、生物素化和抗兔二抗(37℃孵育1.0 h)、PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，Mayer蘇木素復染，脫水，透明及封片，PBS緩沖液替代一抗作為對照。陽性及半定量判斷采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)生獨立審閱所有切片。判斷標準：每個視野計數(shù) 100 個細胞，依據(jù)陽性細胞的比率及染色度進行判定。①陽性細胞比例評分：陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)<10%為0分；陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)10%～25%為1分；陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)26%～50%為2分；陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)>50%為3分。②染色深度評分：無染色為0分；淡黃色為1分，黃色至棕黃色為2分；深黃色至深棕黃色為3分。③總積分=陽性細胞比例評分+染色深度評分：0 分陰性(-)，≥1分陽性(+)。采用Microdensitometer對染色切片進行定量，每張切片測試5個區(qū)域，計算每個區(qū)域抗原的百分比，求均值，以每批切片的陰性對照調(diào)零，并對玻片校正厚度，消除玻片厚度對結(jié)果的影響。

1.4細胞壞死率為化療效果的判斷依據(jù) 化療前活檢標本和術(shù)后切除的瘤體均行HE染色，每張切片隨機取5個視野，計數(shù)存活的腫瘤細胞。腫瘤細胞壞死率=(化療前細胞數(shù)-化療后細胞數(shù))/化療前細胞數(shù)×100%。細胞壞死率≥90%為化療效果良好，<90%為化療效果不佳。

1.5生存分析 完成最后一次化療作為隨訪時間起點，以復診、電話、微信和E-mail方式記錄所有患者出現(xiàn)復發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移及死亡的病例。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行t、χ2檢驗，相關(guān)性行Spearman分析，生存率采用Log-rank檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1分別在細胞質(zhì)及細胞核表達。與骨軟骨瘤組比，OS組miR-195和Beclin1陽性或半定量表達明顯降低(P<0.001)，核糖體蛋白L34陽性或半定量表達明顯增高(P<0.001)，見表2、表3和圖1。

表2 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1陽性表達〔n(%)〕

表3 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1半定量表達

圖1 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(DAB，×200)

2.2OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1相關(guān)性 miR-195與核糖體蛋白L34和Beclin1分別呈負和正相關(guān)(r=-0.64,0.68,均P<0.05)，核糖體蛋白L34和Beclin1呈正相關(guān)(r=0.72,P<0.05)。

2.3miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與化療效果的關(guān)系 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達呈陰性、陽性及陰性者化療效果不佳，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

2.4miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與5年生存時間的關(guān)系 OS組均獲得5年隨訪，存活26例(46.43%)，死亡30例(53.57%)，轉(zhuǎn)移16例、復發(fā)12例、交通意外死亡1例、不明原因死亡1例。 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達分別為陽性、陰性和陽性的患者5年生存時間均顯著較長(χ2=4.207,P=0.040；χ2=4.033,P=0.045；χ2=4.858,P=0.028)，見圖2。

圖2 OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與5年生存時間

表4 OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與化療效果的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

miR-195是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小分子RNA，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生等多種病理過程〔6〕。本課題結(jié)果提示miR-195在人OS病變中起保護作用，檢測癌組織miR-195表達可評估患者預后。研究顯示〔7～11〕，miR-195在結(jié)腸癌組織中的表達水平減少與結(jié)腸癌患者低生存率有明顯相關(guān)性，與miR-195具有抑制結(jié)腸癌癌細胞侵襲及遷移相關(guān)；原位雜交顯示miR-195在轉(zhuǎn)移前列腺癌組織中的表達顯著低于非轉(zhuǎn)移前列腺癌組織，在前列腺癌細胞中高表達的miR-195能夠抑制細胞的遷移和侵襲能力,同時上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化常見標識蛋白波形蛋白及N-鈣黏素水平降低。miR195可作為靶向調(diào)控的化療干預。

核糖體蛋白L34 是一種保守的核糖體蛋白，在惡性腫瘤中均表現(xiàn)出核糖體外功能〔4,12,13〕，如人胃癌細胞株 SGC-7901 的核糖體蛋白L34 表達敲減可增加細胞凋亡，抑制細胞增殖，迫使細胞分裂周期阻滯在 S 期，核糖體蛋白L34 高表達可促進非小細胞肺癌細胞株H1299增殖，且在非小細胞肺癌組織呈現(xiàn)過表達，核糖體蛋白L34 在人胰腺癌組織和胰腺癌細胞株中過表達，參與抑癌基因 RPL34基因啟動子的甲基化過程，該過程降低了RPL34基因的抑癌作用。敲除核糖體蛋白L34可有效抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和耐藥性，致使胰腺癌細胞停滯于G2 期進而凋亡，可見核糖體蛋白L34參與癌細胞的增殖、周期及抗凋亡過程，上述作用可能與核糖體蛋白34 表達改變絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p53 信號通路活性相關(guān)，MAPK/p53 信號有助于調(diào)控癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移〔14〕。本課題結(jié)果顯示核糖體蛋白L34在人OS呈高表達，參與人OS的發(fā)生發(fā)展過程。

Beclin1參與腫瘤細胞自噬，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑瘤和促瘤雙重作用〔5,15〕。一方面，Beclin1可通過增強腫瘤細胞的自噬活性，誘導腫瘤細胞自噬性凋亡，抑制腫瘤的發(fā)展。該作用較典型地表現(xiàn)在肝癌、卵巢癌和前列腺癌等惡性腫瘤中， Beclin1基因缺失或突變，Beclin1表達也呈下調(diào)狀態(tài)〔16,17〕。另一方面，Beclin1 可通過 PI3K 通路形成自噬復合物，抑制下游信號通路p53，抑制細胞凋亡，促進腫瘤發(fā)展，例如在胃癌和肺癌的表達是上調(diào)的，隨著腫瘤級別的增高而表達增高〔18〕。本課題Beclin1 陽性表達的OS患者5年生存率明顯高于陰性表達的患者，以往也有類似報道〔19〕，而且Beclin1 陽性表達的患者化療效果較好，差異無統(tǒng)計學意義，可能與納入案例較少有關(guān)。離體研究也顯示，Beclin1基因過表達可以激活人OS MG63細胞株的凋亡，抑制其增殖〔18〕?？梢娙薕S中Beclin1依賴的腫瘤自噬表現(xiàn)出抑瘤機制，增強機體的依賴Beclin1 型腫瘤自噬有助于治療腫瘤，改善患者生存狀態(tài)。

綜上，人OS患者miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達水平與預后密切相關(guān)，miR-195和Beclin1表達水平越高，核糖體蛋白L34表達越低，預后較好。

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