李國軍，胡海巖，王永霞，杜勇俊，張媛媛，常彩紅，林英姿

（海南醫(yī)學(xué)院1.臨床學(xué)院，2.熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗學(xué)院，海南 ?？?571109）

單純皰疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus，HSV-1）屬于皰疹病毒科α病毒亞科，為DNA病毒，其引起的角膜炎致盲率居各種角膜病之首，引起的病毒性腦炎死亡率、致殘率較高。臨床常用的抗HSV-1藥物主要為核苷類，不僅副作用較大且易產(chǎn)生耐藥性，因此研發(fā)高效且副作用小的抗病毒藥物尤為重要[1-2]。

課題組前期從海南紅樹林中分離出一株淡紫擬青霉，其產(chǎn)生的胞外多糖初步證實具有一定的抗病毒作用。本研究擬進一步探討該多糖的抗病毒作用，為篩選新型抗病毒藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物淡紫擬青霉胞外多糖由本實驗室獲得，用雙蒸水配成20 g/L母液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存。臨用時以DMEM維持液稀釋至所需濃度。

1.1.2 試劑及細胞株DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胰酶（美國Amersco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），MTT（美國Sigma公司），Vero細胞（美國ATCC細胞庫，CCL81）。

1.1.3 病毒株單純皰疹病毒Ⅰ型由海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗學(xué)院實驗室保存。

1.1.4 儀器設(shè)備生物安全柜（美國Baker公司，SG403A-HE），酶聯(lián)免疫檢測儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司，NU-4750E），倒置顯微鏡（深圳拓天儀器設(shè)備有限公司），電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）等。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度測定將24孔板中生長狀態(tài)良好的Vero細胞培養(yǎng)液吸棄，加入用DMEM維持液作10倍系列梯度稀釋（1×10-9～1×10-1）的HSV-1病毒株1 ml，每一稀釋度設(shè)6個復(fù)孔，將不加病毒液的正常細胞作為對照，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后棄上清液，加入完全培養(yǎng)液1 ml/孔。逐日觀察細胞病變程度（cytopathic effect，CPE），記錄細胞病變情況，無細胞病變?yōu)椋?），1%～25%細胞病變?yōu)椋?），26%～50%細胞病變?yōu)椋?+），51%～75%細胞病變?yōu)椋?++），76%～100%細胞病變?yōu)椋?+++）。當病毒對照組CPE達（+++）以上時終止培養(yǎng)，判定結(jié)果。按Reed-Muench公式，計算病毒半數(shù)感染量（50%tissue culture infective dose，TCID50）以確定病毒滴度[3]。實驗重復(fù)3次。

lgTCID50=距離比×稀釋度對數(shù)之差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)

距離比=高于50%病變率的百分數(shù)-50%/（高于50%病變率的百分數(shù)-低于50%病變率的百分數(shù)）

1.2.2 淡紫擬青霉胞外多糖的細胞毒性測定將不同稀釋度淡紫擬青霉胞外多糖加入96孔板生長狀態(tài)良好的Vero細胞中，100μl/孔，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，設(shè)不加藥物的維持液作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，隔天換液1次，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入5.0 mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入二甲亞砜100μl/孔，振蕩5min，用酶標儀測定570 nm處光密度（optical density,OD）值，取6孔平均值計算各濃度細胞存活率及藥物對細胞的半數(shù)有毒濃度（50%cytotoxic concentration，CC50）。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 MTT法檢測淡紫擬青霉胞外多糖對病毒的直接滅活作用將不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖與100 TCID50病毒液等體積混合，于37℃接觸2 h，各管病毒依次10倍稀釋，加入單層96孔板Vero細胞中，100μl/孔，感染2 h后換完全培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察CPE，待病毒對照孔CPE達（+++）(++++）且細胞對照正常時，吸棄培養(yǎng)液，MTT法檢測病毒抑制率。每一藥物濃度設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)病毒對照組和正常細胞對照組。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測淡紫擬青霉胞外多糖對病毒的吸附作用在單層96孔板Vero細胞中加入100 TCID50HSV-1，100μl/孔，同時加入不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖，每一濃度設(shè)6個復(fù)孔，37℃孵育2 h，吸棄孔內(nèi)液體，加入維持液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至病毒對照孔CPE達（+++）(++++）且細胞對照正常時，MTT法測淡紫擬青霉胞外多糖對病毒的吸附作用。同時設(shè)病毒對照組和正常細胞對照組。實驗重復(fù)3次。

抑制率（%）=（實驗組OD值-病毒對照組OD值）/（正常細胞對照組OD值-病毒對照組OD值）

1.2.5 MTT法檢測淡紫擬青霉胞外多糖對病毒生物合成的影響以100 TCID50的HSV-1感染96孔板中Vero細胞，37℃孵育2 h，吸棄病毒液，加入不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖，每一濃度設(shè)6個復(fù)孔，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，待病毒對照CPE達（+++）(++++）且細胞對照正常時，MTT法測淡紫擬青霉胞外多糖對病毒生物合成的影響。同時設(shè)病毒對照組和正常細胞對照組。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism 6統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，量效關(guān)系采用回落歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 接種病毒滴度

按Reed-Meuench法計算病毒的TCID50為10-4.6，即100μl接種滴度為10-4.6的病毒，可使50% Vero細胞發(fā)生明顯病變，實驗用病毒為100 TCID50。

2.2 淡紫擬青霉胞外多糖對Vero細胞的毒性

淡紫擬青霉胞外多糖對Vero細胞的CC50為1 724.2μg/ml，多糖濃度＜900.0μg/ml時，細胞存活率＞90%；多糖濃度為1 000μg/ml時細胞存活率為84.6%；當多糖濃度＞1 000μg/ml時，細胞存活率＜80%。因此，后續(xù)實驗用多糖濃度控制在＜1 000μg/ml，在所用多糖濃度范圍內(nèi)未見其對Vero細胞有增殖作用，說明該多糖對Vero細胞毒性較低，是一種非常安全的多糖（見圖1）。正常Vero細胞和淡紫擬青霉胞外多糖作用后的Vero細胞見圖2、3。

圖1 淡紫擬青霉胞外多糖濃度與Vero細胞存活率的關(guān)系

圖2 正常Vero細胞 （×100）

圖3 1 000.0μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖作用72 h的Vero 細胞 （×100）

2.3 淡紫擬青霉胞外多糖對病毒無直接滅活作用

25～1 000μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖對HSV-1直接作用的TCID50相同，均為10-4.3，說明該多糖對HSV-1無直接滅活作用。

2.4 淡紫擬青霉胞外多糖干擾HSV-1吸附

當病毒對照組CPE達（+++）以上時，淡紫擬青霉胞外多糖作用的Vero細胞CPE（+）～（+++）不等，說明在所用濃度范圍內(nèi)該多糖具有一定的抗病毒作用，且表現(xiàn)出一定量效關(guān)系。HSV-1回歸方程：Y=0.0647X+7.879，R=0.982，其半數(shù)抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）為 650.7μg/ml。50～1 000μg/ml多糖對病毒吸附的抑制作用與病毒對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明該多糖可在一定程度上干擾病毒吸附，即使多糖濃度達1 000μg/ml時，抑制率僅為65.3%，并未達到完全抑制。見附表。

2.5 淡紫擬青霉胞外多糖抑制HSV-1的生物合成

25～1 000μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖對HSV-1生物合成作用有不同程度的抑制，且隨著藥物濃度增加，抑制率逐漸升高，CPE逐漸減輕，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。HSV-1回歸方程：Y=0.076X+8.376，R=0.980，其IC50為547.7μg/ml，25～1 000μg/ml多糖對病毒吸附的抑制作用與病毒對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。當多糖濃度達1 000μg/ml時，抑制率為75.3%，說明該多糖對病毒生物合成作用有較強的抑制作用，但仍不能達到完全抑制。見附表。

附表 淡紫擬青霉胞外多糖對HSV-1吸附及生物合成的影響 （±s）

附表 淡紫擬青霉胞外多糖對HSV-1吸附及生物合成的影響 （±s）

組別對吸附的抑制作用 對生物合成的影響CPE OD值 抑制率/% CPE OD值 抑制率/%25μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （+++） 0.456±0.06 8.3±5.7 （+++） 0.457±0.05 5.1±3.8 50μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （+++） 0.468±0.13 10.8±12.6 （+++） 0.487±0.06 11.3±7.6 100μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （+++） 0.489±0.06 15.0±5.3 （+++） 0.523±0.12 18.6±13.5 200μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （+++） 0.511±0.02 19.5±1.8 （+++） 0.556±0.02 25.4±3.9 300μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （+++） 0.568±0.11 31.0±10.9 （+++） 0.591±0.14 32.5±21.6 400μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （++） 0.601±0.04 37.7±4.3 （++） 0.642±0.06 42.9±11.6 500μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （++） 0.633±0.01 45.1±0.9 （++） 0.694±0.02 53.6±3.7 600μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （++） 0.665±0.05 51.8±5.1 （++） 0.730±0.04 60.9±8.1 700μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （++） 0.689±0.13 56.7±12.9 （++） 0.750±0.11 65.1±15.0 800μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （++） 0.703±0.12 59.6±12.1 （++） 0.773±0.05 69.8±9.1 900μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （++） 0.719±0.02 62.9±1.5 （++） 0.786±0.02 72.4±4.0 1 000μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖 （+） 0.730±0.07 65.3±7.0 （+） 0.800±0.06 75.3±11.9病毒對照組 （+++） 0.415±0.06 （+++） 0.432±0.01 Vero細胞對照組 （-） 0.908±0.12 （-） 0.921±0.03 F值 48.392 129.704 84.413 96.832 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

多糖類化合物具有良好的生物活性，早在1943年便開始作為藥物使用。紅樹林真菌由于生活在寡營養(yǎng)、弱堿性的含鹽海洋環(huán)境中，形成了獨特的耐饑、耐堿和耐鹽特性，使其可產(chǎn)生出完全不同于陸生真菌的新穎生物活性物質(zhì)[4-5]。研究表明，紅樹林真菌胞外多糖主要為雜多糖，具有良好的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[6-7]。

課題組前期從海南紅樹林中分離獲得一株淡紫擬青霉[8]。經(jīng)證實該株真菌產(chǎn)生的胞外多糖在體外有減輕單純皰疹病毒和柯薩奇病毒的致細胞病變效應(yīng)[9]。體內(nèi)實驗證實，該多糖可延長單純皰疹病毒顱內(nèi)感染小鼠的生存時間，提高存活率[11]，說明該多糖具有一定的抗病毒作用。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究以Vero細胞作為病毒感染靶細胞，進一步探討其抗HSV-1的作用。研究發(fā)現(xiàn)，該多糖對Vero細胞的CC50為1 724.2μg/ml，多糖濃度＜900μg/ml時細胞存活率＞90%，說明該多糖對Vero細胞的毒性作用較小，對細胞無明顯增殖作用，是一種非常安全的多糖。本實驗將不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖作用于HSV-1感染的不同環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)該多糖對HSV-1無直接殺傷作用，但可抑制病毒吸附，尤其600～1 000μg/ml多糖抑制作用較強，抑制率＞50%，說明該多糖可能具有一定的封閉、改變或競爭細胞表面病毒受體的作用，亦或作用于細胞使細胞處于抗病毒應(yīng)激狀態(tài)。研究還發(fā)現(xiàn)，該多糖對HSV-1生物合成具有一定的抑制作用，其IC50為547.7μg/ml，在所用濃度范圍內(nèi)抑制率與藥物濃度呈量效關(guān)系，尤其600～1 000μg/ml多糖抑制作用較強，抑制率達＞60%，但抑制作用的靶點仍需進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)紅樹林來源的淡紫擬青霉胞外多糖具有一定的抗HSV-1作用，在一定濃度范圍內(nèi)可抑制病毒吸附和生物合成，在900～1 000μg/ml濃度范圍內(nèi)該多糖對HSV-1吸附的抑制率＞60%，對病毒生物合成的抑制率＞70%，說明其抑制病毒生物合成的作用稍強于抑制吸附的作用，但均不能達到完全抑制。本研究僅對淡紫擬青霉胞外多糖的抗病毒作用進行初探，其結(jié)構(gòu)和作用機制仍需進一步研究。

參 考 文 獻：

[1]SZPARA M L , PARSONS L R, ENQUIST L.Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations[J].Journal of Virology, 2010, 84(10):5303-5313.

[2]ANTOINE T E, PARK P J, SHUKLA D.Glycoprotein targeted therapeutics:a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics[J].Reviews in Medical Virology, 2013, 23(3):194-208.

[3]傅繼華.病毒學(xué)實用實驗技術(shù)[M].濟南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2001:61-63.

[4]CHI Z M, FANG Y.Exopolysaccharides from marine bacteria[J].J Ocean Uni China, 2005, 4(1):67-74.

[5]AL-SAYED H A, GHANEM E H, SALEH K M.Bacterial community and some physico-chemical characteristics in a subtropical mangrove environment in Bahrain[J].Marine Pollution Bulletin, 2005, 50:147-155.

[6]YAMADA T, IRITANI M, OHISHI H, et al.Pericosines, antitumour metabolites fromthe sea hare-derived fungus periconia byssoides.Structures and biological activities[J].Org Biomol Chem, 2007,5(24):3979-3986.

[7]AFIYATULLOV S H, KALINOVSKY A I, PIVKIN M V, et al.New diterpene glycosides of the fungus acremonium striatisporum isolated from a sea cucumber[J].Nat Prod Res, 2006, 20(10):902-908.

[8]饒朗毓, 陳政良, 林英姿.一株具免疫增強活性紅樹林真菌的篩選及鑒定[J].中國熱帶醫(yī)學(xué), 2011, 11(6):683-685.

[9]裴華, 林英姿, 饒朗毓.一株海南紅樹林真菌胞外多糖抗病毒活性初步研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2012, 18(2):152-154.

[10]裴華, 林英姿, 饒朗毓.一株紅樹林真菌抗單純皰疹病毒Ⅱ型的研究[J].海南醫(yī)學(xué), 2012, 23(3):1-3.

[11]裴華, 林英姿, 饒朗毓.紅樹林真菌PH0016胞外多糖對單純皰疹病毒Ⅰ型活性的影響[J].山東醫(yī)藥, 2012, 52(7):24-26.