轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

□ 石天臣 黃 學(xué) 王學(xué)鋒 寧夏夏進(jìn)乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司

蛋白質(zhì)是食物的重要成分之一，不僅是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)，其功能特性對于食品的品質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)具有重要的作用。采用物理、化學(xué)、酶法改性蛋白質(zhì)對完善功能性蛋白質(zhì)有重要意義。TG是一種廣泛存在于動(dòng)植物組織中的天然酶制劑，許多食品中都含有天然的TG[1]。TG通過在賴氨酸上ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺基之間催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，使蛋白質(zhì)發(fā)生分子間和分子內(nèi)共價(jià)交聯(lián)。蛋白質(zhì)分子的這種變化有利于形成強(qiáng)有力凝膠，改善各種蛋白制品的彈性、黏和性、保水性等品質(zhì)。

TG在不改變食物pH值、顏色、味道或營養(yǎng)的前提下對蛋白質(zhì)進(jìn)行改性。改性反應(yīng)形成的L-G鍵（Glu-Lys）在人體內(nèi)能被消化吸收，因此TG改性處理不會(huì)降低蛋白的營養(yǎng)價(jià)值。而且酶的交聯(lián)作用將賴氨酰甲硫氨酸二肽或賴氨酰精氨酸二肽結(jié)合到酪蛋白上，彌補(bǔ)蛋白中甲硫氨酸和精氨酸的不足，改善蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[2]。

1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化反應(yīng)機(jī)制

動(dòng)物來源的TG成本極高，目前在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的TG主要是微生物來源的（Microorganism Transglutaminase，MTG）。TG通過胺的導(dǎo)入、交聯(lián)、脫胺三種途徑改變蛋白質(zhì)性質(zhì)。具體反應(yīng)機(jī)制如圖1所示：TG催化蛋白質(zhì)及肽鍵中谷氨酰胺殘基γ-羰基和伯胺之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)如圖1中的（a）所示，利用該反應(yīng)可將賴氨酸引入蛋白質(zhì)以改善營養(yǎng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中賴氨酸殘基γ- 氨基作為?；荏w時(shí)，蛋白質(zhì)在分子之內(nèi)或分子之間形成ε-（γ-谷氨酰）賴氨酸共價(jià)鍵如圖1中的（b）所示，蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)[3]，食品發(fā)生質(zhì)構(gòu)變化，從而賦予產(chǎn)品特有質(zhì)構(gòu)特性和黏合性能；當(dāng)不存在伯胺時(shí)，水會(huì)成為?；荏w，谷氨酰胺殘基脫去胺基，如圖1中的（c），該反應(yīng)可用于改變蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及溶解性。

圖1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化機(jī)理

TG催化蛋白質(zhì)形成聚合物的交聯(lián)程度與底物蛋白的構(gòu)象有關(guān)，并不是所有包含有Glu和Lys殘基的蛋白質(zhì)分子間都可以形成交聯(lián)聚合物。底物蛋白質(zhì)的熱力學(xué)相合性（Thermodynamic consistency） 影響其交聯(lián)反應(yīng)。熱力學(xué)不相同則使蛋白不能在酶催化部位相互重疊，兩兩之間不能反應(yīng)，例如親水蛋白和疏水蛋白相斥也就引起熱力學(xué)不相合[4]。另外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和Lys、Glu殘基部位也影響異源聚合物的形成。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用底物選擇性見表1。

近年來，一些科學(xué)家的研究也與表1基本吻合。2001 年，唐傳核等人用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶分別催化酪蛋白酸鈉和乳清蛋白，結(jié)果表明，酪蛋白中的а-酪蛋白、β-酪蛋白易被催化，而κ-酪蛋白不易被催化，乳清蛋白的β-乳球蛋白、а-乳白蛋白都能被催化，而β-乳球蛋白更易受 MTG的催化[5]。對乳清蛋白進(jìn)行加熱預(yù)處理，同時(shí)添加還原劑可明顯提高 MTG 對乳清蛋白的催化活性。2002 年 Han 等報(bào)道在預(yù)熱情況下酪蛋白和乳清蛋白之間可以聚合，而 2002 年唐傳核等人研究 TG催化異源蛋白聚合機(jī)理，認(rèn)為酪蛋白和乳清蛋白不能聚合[6]；而大豆蛋白和乳清蛋白可以聚合，可見二者之間存在一定的矛盾。對于大豆蛋白和酪蛋白之間能否聚合，至今還未有確鑿的證據(jù)證實(shí)。

目前，研究者普遍認(rèn)可轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性蛋白質(zhì)的主要機(jī)制就是形成了異構(gòu)肽鍵。Sabine Lauber等人得出經(jīng)TG改性的脫脂乳蛋白形成的異構(gòu)肽鍵基本全部是分子間異構(gòu)肽鍵，因此即使少量的酪蛋白交聯(lián)也會(huì)顯著地改變?nèi)榈鞍椎母鞣N功能性質(zhì)。Norbert Raak等人提出異構(gòu)肽鍵的含量和聚合度是酸酪蛋白凝膠增強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)器。文章中將酪蛋白進(jìn)行不同時(shí)間（1、2、3、8、20、24h）的TG酶處理，并以未加酶的酪蛋白為對照組，分別測定不同時(shí)間酶處理的酪蛋白的聚合度（polymerisation degree）和異構(gòu)肽鍵(isopeptide bonds)，并建立聚合度和異構(gòu)肽鍵與酸凝膠強(qiáng)度的函數(shù)關(guān)系圖。從中得出在TG改性酪蛋白溫度和TG濃度一定時(shí)，聚合度只與酶改性時(shí)間有關(guān)，并且隨著聚合度的增加凝膠強(qiáng)度也逐漸增加。在聚合度達(dá)到85%（酶改性3h）時(shí)酸凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大，繼續(xù)增加酶改性時(shí)間（聚合度增大），酸凝膠強(qiáng)度反而減小。異構(gòu)肽鍵在達(dá)到0.08 g /100 g的過程中呈線性增加，達(dá)到0.146 g/ 100 g時(shí)酸凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大（295Pa）。Norbert Raak等人進(jìn)一步得出在相同的異構(gòu)肽鍵含量情況下，聚合物的大小也影響著酸凝膠強(qiáng)度，并且酪蛋白在含有較少的二聚物而較多的多聚物時(shí)形成的酸凝膠性更好。

表1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用底物選擇性表

2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性作用對蛋白質(zhì)功能性的影響

2.1 溶解性

蛋白質(zhì)溶解度由與水接觸的蛋白質(zhì)表面親水性基團(tuán)和疏水性基團(tuán)的比例決定。一般來說，蛋白質(zhì)分子表面上的疏水性基團(tuán)越少，溶解度越高。同時(shí)，蛋白質(zhì)的自身結(jié)構(gòu)和溶液中的pH值、離子強(qiáng)度以及溫度等都是影響蛋白質(zhì)溶解性的重要因素。而蛋白質(zhì)的溶解度影響蛋白質(zhì)功能特性，特別是乳化性、起泡性和凝膠性[7]。

Agyare等人用MTG對熱處理過的乳清分離蛋白分散液進(jìn)行改性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH值為4.0和5.0時(shí)，MTG改性后的乳清蛋白分散液溶解度降低。原因是酶改性反應(yīng)提高了β-乳球蛋白的熱穩(wěn)定性，促進(jìn)其聚合，聚合反應(yīng)生成的G-L鍵改變了蛋白表面基團(tuán)的疏水/親水比率，造成在等電點(diǎn)pH值附近的大量沉淀。蛋白質(zhì)這種表面基團(tuán)的疏水/親水比率變化，會(huì)直接影響產(chǎn)品的彈性、黏著性及咀嚼性等表觀性質(zhì)。蛋白質(zhì)溶解度則直接影響凝膠性、乳化性、黏度、起泡性和持水力等功能特性[8]。

Hong等人發(fā)表了用MTG在不同pH條件下處理豬肉肌原纖維蛋白增加蛋白質(zhì)溶解度的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在低離子強(qiáng)度和pH值為3.0時(shí)，MTG改性的肌原纖維蛋白的溶解度比未經(jīng)酶改性的肌原纖維蛋白提升了50%。原因可能是谷氨酰胺殘基電離，中和帶正電的胺基離子，因此降低了蛋白質(zhì)的水合作用。

Renzetti等人研究發(fā)現(xiàn)，通過MTG催化蛋白質(zhì)發(fā)生脫酰胺反應(yīng)可以增加蛋白質(zhì)的溶解性。富含谷氨酰胺和天冬酰胺的蛋白，如大豆蛋白和小麥蛋白，可以通過酶催化反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天門冬氨酸。所得的脫酰胺蛋白表現(xiàn)為較低的等電點(diǎn)，從而增加蛋白質(zhì)在大多數(shù)微酸食品系統(tǒng)中的溶解度。在高濃度的NaCl溶液中含有大量氯離子，氯離子與帶正電荷的蛋白質(zhì)相結(jié)合，降低了靜電排斥，提高疏水相互作用。這些反應(yīng)會(huì)促使不溶性蛋白質(zhì)聚集體的形成，降低其溶解度。然而，通過MTG催化增加了蛋白質(zhì)的凈負(fù)電荷，這有利于蛋白質(zhì)聚集體的解離，從而增加溶解度。

2.2 凝膠性

蛋白質(zhì)的凝膠作用可以得到具有獨(dú)特物理性質(zhì)的食物，如酸乳，、奶酪，、豆腐，、魚糜等。Damodaran稱凝膠是介于固態(tài)和液態(tài)之間的中間狀態(tài)，通過共價(jià)或非共價(jià)鍵的交聯(lián)，形成能夠維持水或其他它低分子量的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)在食品體系中重要的功能特性之一。此外，凝膠的形成和特性取決于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的形式和程度，反過來又受蛋白質(zhì)種類、濃度、溫度、pH、離子強(qiáng)度及其他成分（如乳糖）的影響。穩(wěn)定的凝膠通常形成在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

經(jīng)TG催化的酪蛋白凝膠與正常酸凝膠和凝乳酶形成的酪蛋白凝膠相比，其凝膠形成速度快并伴隨較高的黏粘彈性模量。與熱處理相比，TG的交聯(lián)作用可以促進(jìn)較低含量，甚至不能成膠的蛋白質(zhì)形成凝膠，并且其凝膠的彈性模量和凝膠強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相同條件下的熱凝膠。Motoki M也證明用MTG催化乳蛋白，通過蛋白質(zhì)之間的相互交聯(lián)，能夠在相對較低的蛋白質(zhì)濃度下得到高彈性、不可逆的凝膠。但是Huppertz T發(fā)現(xiàn)用TG催化酪蛋白之后在凝乳酶的誘導(dǎo)下絮凝時(shí)間卻比較長。而且絮凝時(shí)間與k-酪蛋白單體殘基呈線性相關(guān)，也就是說在TG完全交聯(lián)情況下的絮凝是不存在的。文中進(jìn)一步證明TG抑制凝乳酶的絮凝主要是在絮凝的第二階段如酪蛋白絮凝的凝膠強(qiáng)化階段。TG改性酪蛋白后，凝乳酶誘導(dǎo)形成凝膠的時(shí)間還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

Ardelean等人向牛奶中加入MTG（3U /g 蛋白質(zhì)）于40℃處理60min，之后在85 ℃滅酶10min，通過加入40g/L D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯模擬微生物產(chǎn)酸，促進(jìn)凝膠的形成。SDS-PAGE電泳結(jié)合相對光密度掃描發(fā)現(xiàn)牛奶中31%的蛋白發(fā)生交聯(lián)，并有效改善了凝膠的強(qiáng)度和減少酸凝膠的乳清析出。然而Guo等人發(fā)現(xiàn)過量的TG會(huì)引起凝膠的強(qiáng)度降低，原因可能是過量的交聯(lián)產(chǎn)生的大量高分子聚合物會(huì)抑制蛋白均勻網(wǎng)絡(luò)的生成。Sabine Lauber等人向脫脂牛奶中加入10.5U/mLl的MTG于40孵育150min，然后經(jīng)熱處理滅活。這個(gè)改性后的酸奶的破碎強(qiáng)度從550CN增加到920CN。Smiddy M A證明了經(jīng)TG改性的酪蛋白形成的分子間交聯(lián)使酪蛋白膠束粒子由締合膠體粒子轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒛z粒子。經(jīng)TG改性的酪蛋白膠束穩(wěn)定性更好，增強(qiáng)了酪蛋白膠束對分散劑、熱處理、酸和酒精等的穩(wěn)定性。

Herrero等人將新鮮豬肉制成肉糜，分別添加0%、0.05%、0.1%的MTG，在4℃，20kPa反應(yīng)72h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過MTG催化引入的交聯(lián)極大地改變了肌球蛋白重鏈的結(jié)構(gòu)，改進(jìn)了蛋白質(zhì)的硬度，、彈性，、結(jié)合力和黏粘合性，從而導(dǎo)致凝膠具有緊密和有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過拉曼光譜分析得出，其中，α-螺旋結(jié)構(gòu)大幅減少，β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)大幅增加。中國南京肉食質(zhì)量與安全控制中心研究TG處理肌纖維分離蛋白和大豆分離蛋白時(shí)，溫度和離子強(qiáng)度對該反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，大豆分離蛋白中除了大豆球蛋白外大部分蛋白質(zhì)在溫度大于50℃會(huì)被TG交聯(lián)。在溫度由20℃到～90℃的變化過程（每10℃測一個(gè)樣，共八個(gè)樣品共8個(gè)樣品）中，肌動(dòng)蛋白的SDS-PAGE電泳條帶逐漸變淺。說明隨著溫度的升高，肌動(dòng)蛋白參與酶改性反應(yīng)越來越顯著。而添加了KCL會(huì)阻止電泳條帶的變淺，說明肌動(dòng)蛋白的酶改性反應(yīng)會(huì)被離子抑制。流變性測試也表明，在不考慮酶改性時(shí)間的影響下，酶改性顯著提高了肌纖維分離蛋白凝膠的彈性，也顯著改善了肌纖維分離蛋白和大豆分離蛋白混合物凝膠的凝膠性能。

2.3 持水力

持水力是指蛋白質(zhì)構(gòu)成的基體通過物理方式截留大量水而阻止水滲出的能力。蛋白質(zhì)的持水力對肉制品和面包的感官品質(zhì)有著重要的影響。

Imm等人在脫脂乳中添加4種梯度（5、10、15、20 U/g蛋白）的TG，在40℃下反應(yīng)3h，在85℃5min滅酶后冷凍干燥成改性脫脂乳粉。通過對改性脫脂乳粉進(jìn)行復(fù)溶凝膠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)改性的脫脂乳粉相比，改性后的脫脂乳粉的熱誘導(dǎo)（90℃，30min）凝膠及GDL誘導(dǎo)的酸凝膠，其凝膠強(qiáng)度和持水力均顯著提高。其中，當(dāng)添加量為10U/g時(shí)，凝膠強(qiáng)度和持水力最強(qiáng)。流變測量的結(jié)果顯示酶改性后的脫脂乳粉形成凝膠的速度更快以及更具有彈性。因此，通過這種方法制備的酸凝膠，提升了凝膠的持水力，表明它可用于低脂肪酸奶的制造，以減少酸奶在生產(chǎn)運(yùn)輸過程中的脫水收縮。

Han等人研究發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白中酶的濃度達(dá)到一定程度后，凝膠持水力與酶濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。這是因?yàn)槊傅臐舛壬撸鞍踪|(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)增多，使蛋白質(zhì)與水的結(jié)合作用程度降低。所以在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制添加酶的量。

2.4 黏度

黏度是流體黏滯性的一種量度，是流體流動(dòng)力對其內(nèi)部摩擦現(xiàn)象的一種表示。它是幾個(gè)復(fù)雜變量之間相互作用的表現(xiàn)，其中粒徑、形狀、蛋白質(zhì)和溶劑的相互作用、流體力學(xué)體積以及水合態(tài)下分子的靈活性都影響?zhàn)ざ取raun等人研究發(fā)現(xiàn)，溶液濃度越高，粒徑越大，在溶液中分子的密度就越大，分子之間發(fā)生相互作用減少了分子之間的空間，表現(xiàn)出較低的流動(dòng)性和較高的黏度。

在許多食品中，例如酸奶和冰淇淋，黏度是產(chǎn)品品質(zhì)的主要標(biāo)準(zhǔn)之一，與乳化性和凝膠性緊密地聯(lián)系在一起。Gauch等人將全脂乳和乳清蛋白液按不同比例混合后，加入MTG（0.5U/g）于40℃下反應(yīng)2h，然后80℃ 2 min滅酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有經(jīng)酶改性的酸奶比對照組表現(xiàn)出更高的表觀黏度和稠度。因?yàn)榻宦?lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量的高分子聚合物，減少了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中水的流動(dòng)性，給予產(chǎn)品適當(dāng)?shù)某矶?。根?jù)Bμnisch等人的研究表明，酶的濃度越高，其促進(jìn)產(chǎn)生的交聯(lián)程度越高，樣品的聚合程度和黏度越大。在用MTG處理αs-酪蛋白和β-酪蛋白的蛋白膜實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，表面黏度比對照組增加了近100倍，其中β-酪蛋白膜增加的更快。這與Rodriguez-Nogales的研究結(jié)果是一致的，原因是β-酪蛋白含有大量非均勻排列的疏水基和親水基，使其具有典型的表面活性劑特性，尤其是在油/水乳狀液界面吸附上。

3 結(jié)論與展望

本文介紹了TG改性蛋白質(zhì)的主要機(jī)制是通過酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，使蛋白質(zhì)之間形成異構(gòu)肽鍵。蛋白質(zhì)之間相互交聯(lián)，形成分子量較大的聚合物并改變了蛋白質(zhì)的疏水性，影響了蛋白質(zhì)的溶解性，從而改變與溶解性密切相關(guān)的凝膠性、黏度和持水力等特性。

蛋白聚合技術(shù)已被越來越多地應(yīng)用于食品工業(yè)中，有效地改善特定食品的功能特性。TG則是目前蛋白交聯(lián)中研究最廣泛和深入的一種酶。微生物發(fā)酵制造TG的技術(shù)也為TG投入市場應(yīng)用提供了可能性。并且經(jīng)過TG改性的蛋白質(zhì)可以被機(jī)體所分解吸收，通過動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)，研究者也發(fā)現(xiàn)，大白鼠飼喂經(jīng)TG處理的酪蛋白與飼喂天然酪蛋白相比較，其增重、蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)生物價(jià)均相同。通過分析大白鼠的尿液和糞便證實(shí)有99%的L-G基團(tuán)被動(dòng)物吸收。因此TG改性蛋白質(zhì)的市場前景是很可觀的。但目前研究MTG交聯(lián)蛋白質(zhì)的機(jī)理和改性蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的消化吸收過程的文章還是比較少，有待進(jìn)一步研究。